pe表面改性及其抗凝血性能研究

pe表面改性及其抗凝血性能研究

由于苯二甲酸乙二醇酯（pe）的良好耐用性，已被用作人工血管?？p合人工心臟瓣膜，縫合心臟瓣膜上的碎片，縫合人工韌帶和醫(yī)療接頭。但由于聚酯的分子結(jié)構(gòu)對(duì)稱(chēng),結(jié)晶度較高,結(jié)構(gòu)中又沒(méi)有高極性基團(tuán),因此親水性較差,植入體內(nèi)時(shí)血液相容性也較差。由于聚酯是高結(jié)晶性聚合物,非晶區(qū)相對(duì)較少,分子主鏈又缺少可供接枝的活性基團(tuán),因而接枝改性較困難,作者主要采取紫外輻照手段,使表面的C—H產(chǎn)生均裂形成自由基,再接枝親水性高聚物聚乙二醇(PEG),最后通過(guò)化學(xué)偶合法接枝抗凝血藥物肝素(Hep)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)試劑和儀器紫外照射裝置,自制;754型分光光度計(jì),上海科析儀器成套公司;X-650型掃描電子顯微鏡;AAc(AR),天津化學(xué)試劑廠;肝素(效價(jià)≥150u/mg),上海佰奧生物科技有限公司;甲苯胺蘭(AR),百靈威公司美國(guó)SIGMA進(jìn)口分裝;檸檬酸鈉(AR),重慶天府精細(xì)化學(xué)品廠;乙酸異戊酯(AR),廣東西隴化工廠。1.2干預(yù)厚膜將PET膜裁剪成2cm×2cm的正方形試樣,經(jīng)丙酮、三氯甲烷、甲醇分別振蕩清洗后,真空干燥24h備用。1.3共輻射法peg將PET膜浸入PEG中,在紫外照射裝置中輻照接枝一定時(shí)間。取出后用蒸餾水清洗8h。干燥備用。1.4共價(jià)偶合費(fèi)詩(shī)集peg1.4.1輻照接枝n氣保護(hù)將丙烯酸(AAc)用適量活性炭吸附阻聚劑對(duì)苯二酚,過(guò)濾后充入N2以除去溶液中的O2。配置0.3%的高碘酸鈉的丙酮溶液,滴加在PET膜上,溶劑揮發(fā)后。將膜片浸入10%(w/w)的丙烯酸水溶液中,在紫外照射裝置中進(jìn)行輻照接枝(N2氣保護(hù))。接枝完后的PET-AAc膜片在70℃蒸餾水中,攪拌下充分洗滌以除去均聚產(chǎn)物。自然晾干備用。1.4.2羧基化反應(yīng)edc的合成將PET-AAc膜片放入pH=4.7的蒸餾水中,加入對(duì)應(yīng)比例的EDC,4℃冰浴下活化羧基2h。倒入PEG(或氨基端PEG)水溶液,冰浴下攪拌反應(yīng)2h。撤去冰浴,室溫下繼續(xù)反應(yīng)22h。取出膜片,蒸餾水清洗24h。干燥備用。1.5-冰浴下攪拌將肝素配成水溶液(pH=4.7),加入對(duì)應(yīng)比例的EDC4℃冰浴下攪拌反應(yīng)2h。將接枝了PEG(或氨基端PEG)的PET膜放入上述混合液中,4℃下反應(yīng)2h,撤去冰浴,室溫下繼續(xù)反應(yīng)22h。取出膜片,蒸餾水清洗24h,干燥備用。1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制向加塞錐形瓶中加入4mg若丹明6G,加入4ml磷酸緩沖液(PBS,pH=12)溶解。立即加入100ml苯,劇烈震蕩進(jìn)行萃取。將上層黃色萃取液作為染色劑。將染色劑適當(dāng)稀釋,使其在486nm的吸光度為0.4。配制不同濃度的丙烯酸溶液,分別加入一定量的染色劑,攪拌均勻,移入比色皿中,讀取486nm處的吸光度。以丙烯酸含量(?μg)為橫坐標(biāo),486nm處吸光度為縱坐標(biāo),制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1cm×1cm的待測(cè)試樣加入染色劑中,讀取486nm處的吸光度。對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得PET膜片上接枝丙烯酸含量。1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在含0.1mg/ml肝素NaCl水溶液0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5ml的試管中分別加入5.0,4.9,4.8,4.7,4.6,4.5ml?NaCl水溶液(0.2%),使總體積為5.0ml。向各個(gè)試管中分別加入1ml甲苯胺蘭NaCl水溶液(50mg/ml),混合均勻。各加入1ml正己烷,劇烈震蕩30s,吸去上層有機(jī)物。讀取水層在631nm處的吸光度。以肝素含量(?μg)為橫坐標(biāo),631nm吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將表面接枝有肝素的PET膜片剪成細(xì)條狀,在甲苯胺蘭NaCl水溶液中浸放2h,加入正己烷震蕩后,讀取水層在631nm處的吸光度。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得PET膜片上肝素接枝量。1.8富血小板血漿prp和乙酸異戊酯分離更需規(guī)范制備共輻射接枝改性組(PET-PEG400、PET-PEG400-Hep)和逐步接枝改性組(PET-AAc-PEG6000-Hep)PET薄膜數(shù)張。將試樣經(jīng)酒精浸泡2min,然后用大量蒸餾水沖洗,再用生理鹽水沖洗后,在生理鹽水中浸泡24h。從兔心臟取血,加入3.8%檸檬酸鈉抗凝劑。血液在硅化試管中于室溫下離心10min(1000r/min)。用硅化吸管吸取上層富血小板血漿(PRP)置于硅化試管中,37℃恒溫水浴3min。將試樣放入新鮮的PRP中,于37℃水浴中孵育1h后取出,用pH7.4的PBS輕輕洗滌樣品,然后用2.0%的戊二醛固定(4℃,24h)。固定后,用50%-75%-95%-100%梯度的乙醇逐級(jí)脫水各10～15min,再用50%-75%-95%-100%梯度的乙酸異戊酯(第二組分為乙醇)脫水各10～15min。最后進(jìn)行CO2臨界干燥,鍍金,掃描電鏡觀察。2結(jié)果與討論2.1peg對(duì)材料表面親水性的影響圖1和圖2分別反映的是采用不同分子量和不同接枝濃度的PEG進(jìn)行接枝反應(yīng)后,材料表面親水性變化規(guī)律。由圖可知接枝PEG分子量越大,接枝濃度越高,PET膜水接觸角變化越快,親水性越明顯。2.2紫外輻照時(shí)間對(duì)接枝激素量的影響圖3表示的是接枝PEG時(shí)間不同、使用不同分子量PEG空間臂的情況下,在PET表面偶合接枝肝素的量的變化。由圖可知肝素接枝量隨接枝PEG時(shí)間的延長(zhǎng)而增大,可間接地反映出PEG的接枝量也隨著紫外輻照時(shí)間延長(zhǎng)而增大。PEG空間臂的延長(zhǎng)有利于肝素的接枝,這可能是由于肝素屬生物大分子,空間臂的延長(zhǎng)有利于減小其在偶合接枝過(guò)程中的空間位阻。2.3逐步偶合接枝法在PET表面輻照接枝AAc,利用PEG6000作為空間臂偶合接技Hep。結(jié)果如表1所示。與圖3中Hep的接枝量相比,采用逐步偶合接枝法在PET表面接枝的肝素量有了明顯提高。這可能是由于采用逐步接枝法首先在PET上引入了大量的羧基,為下一步偶合接枝PEG提供了更多的反應(yīng)位點(diǎn)。并且由于PEG在接枝過(guò)程中能夠保持分子鏈的完整性,有利于減小肝素接枝時(shí)的空間位阻,而采用共輻照法因?yàn)榻又Ψ磻?yīng)具有一定的隨機(jī)性,所以會(huì)影響PEG的接枝量和分子鏈的完整性,進(jìn)而影響下一步肝素的接枝反應(yīng)。2.4pet表面血小板黏合性圖4(a)至圖4(d)分別為血小板對(duì)空白PET、PET-PEG400、PET-PEG400-Hep和PET-AAc-PEG6000-Hep粘附的掃描電鏡圖片。未改性PET表面血小板粘附數(shù)量最多,而且血小板伸出偽足,變形明顯。PET-PEG表面血小板粘附數(shù)量明顯減少,但仍有血小板伸出偽足,說(shuō)明在PET表面接枝上親水性的PEG分子鏈可以有效地阻止血小板向材料表面靠近,但還不能從根本上抑制血小板的粘附變形。而PET-PEG400-Hep和PET-AAc-PEG6000-Hep由于表面接枝了抗凝血藥物肝素,在材料表面粘附的血小板不僅較PET和PET-PEG少,而且血小板的形態(tài)也保持完好,沒(méi)有偽足和變形。說(shuō)明在材料表面引入肝素可以很好地提高材料的抗凝血性能