迷走神經(jīng)對(duì)大鼠肛溫和cfos表達(dá)的影響

迷走神經(jīng)對(duì)大鼠肛溫和cfos表達(dá)的影響

外源微生物感染后，免疫信息迅速通過(guò)抗原刺激釋放，并自發(fā)地產(chǎn)生免疫反應(yīng)。同時(shí)，將免疫信息傳輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生一系列反應(yīng)。一般認(rèn)為,免疫刺激影響腦的信息物質(zhì)是細(xì)胞因子,細(xì)胞因子分子量大,難以通過(guò)血腦屏障。細(xì)胞因子將免疫信息傳遞到腦的途徑是近幾年研究的熱點(diǎn),現(xiàn)認(rèn)為可能有以下幾種途徑,第一,當(dāng)血液中細(xì)胞因子濃度增高時(shí),其能通過(guò)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上載體介導(dǎo)的可飽和的運(yùn)輸方式通過(guò)血腦屏障;第二,血液中的細(xì)胞因子可以通過(guò)缺乏血腦屏障的室周器官(CVOs)進(jìn)入腦。第三,細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)次級(jí)介質(zhì)的產(chǎn)生,例如前列腺素,將免疫信息傳遞到腦。第四,細(xì)胞因子作用于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞使其表達(dá)粘附分子,并使其通透性增高,而使細(xì)胞因子進(jìn)入腦。另外,近年研究發(fā)現(xiàn)迷走神經(jīng)在免疫信息向腦傳遞過(guò)程中有作用,并進(jìn)行了初步研究。c-Fos是一種原癌基因,它作為一種有效的反映神經(jīng)元對(duì)外界傷害刺激發(fā)生反應(yīng)的標(biāo)志而廣泛應(yīng)用于顯示對(duì)各種傷害性刺激引起反應(yīng)的不同中樞部位。本文檢測(cè)了膈下迷走神經(jīng)切斷對(duì)LPS腹腔注射后所引起的大鼠發(fā)熱及孤束核(NTS)、下丘腦室旁核(PVN)c-Fos蛋白表達(dá)的影響,旨在探討迷走神經(jīng)在外周LPS信息傳遞入腦過(guò)程中的作用。1假手術(shù)方法1.1主要試劑LPS購(gòu)自Sigma公司,來(lái)自大腸桿菌血清型055∶B5,批號(hào)122H4025。c-Fos抗體購(gòu)自邁新公司,為兔多克隆抗體,目錄號(hào)RAB-0187。S-P試劑盒購(gòu)自邁新公司,批號(hào)91013970。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組Wistar大鼠,雄性,體重250~300g,由白求恩醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。隨機(jī)分組,以迷走神經(jīng)切斷并給予LPS組為實(shí)驗(yàn)組,相應(yīng)設(shè)3個(gè)對(duì)照組,包括假手術(shù)生理鹽水組迷走神經(jīng)切斷生理鹽水組,假手術(shù)LPS組。迷走神經(jīng)切斷的實(shí)驗(yàn)方法為:用戊巴比妥鈉(50mg/kg)將大鼠麻醉后,在上腹部剪開(kāi)皮膚及腹膜,切斷迷走神經(jīng)在膈下的腹干和背干,并進(jìn)行幽門(mén)成形術(shù)。假手術(shù)的方法為:麻醉后切開(kāi)上腹部皮膚及腹膜,然后縫合。各組分別于手術(shù)后14d給予LPS0.5ml(25μg/kg)或生理鹽水腹腔注射,測(cè)定動(dòng)物體溫,然后各組分別給予LPS后1h進(jìn)行麻醉后左心室灌注4%多聚甲醛固定,取腦組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,室旁核在耳間線前方6.4~7.0cm,孤束核在耳間線后方11.4~12.4cm。1.3動(dòng)物體溫測(cè)量動(dòng)物于上午8~12點(diǎn)測(cè)定體溫,方法是將大鼠置于特制固定架上,用ST-1數(shù)字體溫計(jì)測(cè)定,將體溫探頭經(jīng)肛門(mén)插入直腸內(nèi)6cm,并固定于尾跟部,待動(dòng)物體溫基本穩(wěn)定后測(cè)定體溫,然后于給藥后60min和80min再次測(cè)定體溫,以60min和80min時(shí)體溫的值減去基礎(chǔ)體溫為體溫變化值(ΔT)。1.4免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)c-Fos蛋白的表達(dá)固定后的腦組織常規(guī)進(jìn)行梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,切片,載玻片上涂多聚賴(lài)氨酸以防止脫片。石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟入水,用S-P試劑盒進(jìn)行染色。用3%H2O2(A液)室溫孵育10min,以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,用胰酶進(jìn)行抗原修復(fù),PBS(0.01mol/L,pH7.4)洗5min×3次,用正常兔血清(B液)室溫封閉切片10min,甩掉封閉液,加上兔抗c-Fos抗體,4℃孵育過(guò)夜,PBS沖洗5min×3次,加生物素標(biāo)記的二抗(C液),室溫孵育30min,PBS洗5min×3次,滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液(D液),室溫孵育30min,DAB顯色,用Mayer蘇木精復(fù)染核,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。每次染色均設(shè)有PBS代替一抗的陰性對(duì)照。在PVN計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。在NTS計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。2結(jié)果2.1兩組大鼠前口溫變化值比較如表1所示,膈下迷走神經(jīng)切斷后明顯地抑制了LPS所致的大鼠發(fā)熱,給LPS后60min和80min時(shí),實(shí)驗(yàn)組大鼠肛溫變化值與假手術(shù)LPS組相比明顯降低,兩時(shí)間點(diǎn)兩組分別相比有明顯差異,P<0.05;與膈下迷走神經(jīng)切斷對(duì)照相比明顯增高,P<0.05。假手術(shù)LPS組大鼠肛溫變化值與假手術(shù)對(duì)照組相比明顯增高,在60min和80min兩時(shí)間點(diǎn)相比兩組有極顯著差異P<0.01。迷走神經(jīng)對(duì)照組大鼠肛溫的變化值與假手術(shù)對(duì)照組相比無(wú)明顯差異,P>0.05。2.2兩組c-fos表達(dá)情況c-Fos免疫組織化學(xué)染色法觀察到,在NTS中c-Fos染色陽(yáng)性細(xì)胞除了細(xì)胞核呈棕黃色之外,細(xì)胞漿也呈棕黃色。實(shí)驗(yàn)組c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞百分率為6%,假手術(shù)LPS組為67.2%,兩組比較有顯著差異,P<0.01;膈下迷走神經(jīng)切斷生理鹽水組為0.5%,與實(shí)驗(yàn)組相比有極顯著差異,P<0.01。假手術(shù)生理鹽水組c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞百分率為0.5%,與假手術(shù)LPS組相比有明顯差異,P<0.01。膈下迷走神經(jīng)切斷生理鹽水組c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞百分率與假手術(shù)生理鹽水組相比無(wú)明顯差異,P>0.05,見(jiàn)圖1和圖2。2.3組患者c-fos表達(dá)情況c-Fos免疫組織化學(xué)染色法觀察到PVN中c-Fos染色陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核呈棕黃色。實(shí)驗(yàn)組c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞百分率為23.5%,假手術(shù)LPS組為43.7%,兩組比較有顯著差異,P<0.01,膈下迷走神經(jīng)切斷生理鹽水組為0.75%,與實(shí)驗(yàn)組相比有極顯著差異P<0.01。假手術(shù)生理鹽水組c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞百分率為0.5%,與假手術(shù)LPS組相比有明顯差異,P<0.01。膈下迷走神經(jīng)切斷生理鹽水組c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞百分率與假手術(shù)生理鹽水組相比無(wú)明顯差異,P>0.05,見(jiàn)圖3和圖4。3精神世界的意義本實(shí)驗(yàn)觀察到LPS腹腔注射引起發(fā)熱的同時(shí),迷走神經(jīng)感覺(jué)傳入神經(jīng)到達(dá)的核團(tuán)NTSc-Fos陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯增高,PVNc-Fos陽(yáng)性細(xì)胞百分率亦明顯增高,表明外周給入LPS使迷走感覺(jué)傳入神經(jīng)活動(dòng),從而使其傳入纖維到達(dá)的核團(tuán)——NTS神經(jīng)元呈現(xiàn)活動(dòng)狀態(tài)。有作者通過(guò)解剖學(xué)研究觀察到,從NTS發(fā)出纖維有部分投射到PVN。因此推測(cè)NTS神經(jīng)元活動(dòng)會(huì)影響PVN神經(jīng)元活動(dòng)。本文發(fā)現(xiàn)發(fā)熱的同時(shí)NTS和PVN活動(dòng)神經(jīng)元均增多,提示NTS神經(jīng)元的活動(dòng)有可能會(huì)引起PVN神經(jīng)元的活動(dòng)。我們進(jìn)一步用膈下迷走神經(jīng)切斷動(dòng)物模型來(lái)探討這個(gè)問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),膈下迷走神經(jīng)切斷后,動(dòng)物發(fā)熱明顯降低,NTSc-Fos陽(yáng)性神經(jīng)元百分率降低10倍,而PVNc-Fos陽(yáng)性神經(jīng)元百分率降低了0.