細(xì)胞培養(yǎng)過程中遺傳變異 植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)過程中的遺傳變異離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點(diǎn)體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)體細(xì)胞突變體誘導(dǎo)與篩選的方法遺傳與變異特點(diǎn)離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性離體培養(yǎng)下的變異影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性

離體培養(yǎng)的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是有絲分裂，有絲分裂的DNA半保留復(fù)制和染色體的均等分裂機(jī)制，從理論上可以保證離體培養(yǎng)物在一般情況下的遺傳穩(wěn)定性。

離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)的另一個方面是即使發(fā)生某些變異，只需根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方式進(jìn)行離體繁殖，即可淘汰或選擇變異、或分離純合體。被仿效的譯本叫做顯性，另一個則叫做隱性；換句話說，根據(jù)突變是否直接影響到模式的改變，稱之為顯性突變或隱性突變。如何鑒別顯性突變和隱性突變利用雜交試驗(yàn)的方法，可以區(qū)分顯性突變還是隱性突變。以上例而言，讓矮桿突變體植株與原始親本雜交，若F1表現(xiàn)高桿，F(xiàn)2中既有高桿，也有矮桿植株，說明矮桿突變是隱性突變。若是顯性突變情況又如何呢？F1表現(xiàn)為矮桿，F(xiàn)2中矮桿：高桿為3：1。離體培養(yǎng)下的變異特點(diǎn)普遍性：變異可發(fā)生在各種培養(yǎng)類型中；各種培養(yǎng)植物中局限性：從表型上看，在不同植物類型中經(jīng)常發(fā)生的體細(xì)胞變異主要是植株形態(tài)（株高、葉形、葉色等）、生長勢、育性、某些抗性等性狀的變異。從生理生化特性上看，容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝的消長等變異。嵌合性：嵌合性是指同一有機(jī)體中同時(shí)存在有遺傳組成不同的細(xì)胞。嵌合體可以以不同倍性的形式存在，必須分離培養(yǎng)才能純化。離體培養(yǎng)再生植株的表型變異頻率植物種類再生植株來源變異頻率(%)煙草體細(xì)胞愈傷組織10水稻胚愈傷組織71.9甘蔗幼葉愈傷組織>18玉米體細(xì)胞愈傷組織14大麥花粉植株10－15馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體100菠蘿頂芽愈傷組織7腋芽愈傷組織34幼果愈傷組織100離體培養(yǎng)變異的影響因素供體植物遺傳背景倍性水平，二倍體比單倍體穩(wěn)定基因型生理狀態(tài)來源于莖尖的愈傷組織的DNA含量及染色體數(shù)的穩(wěn)定性好于來源于薄壁細(xì)胞的繼代培養(yǎng)的次數(shù)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式1.8亞二倍體是指正常的46條染色體丟失一個或多個染色體繼代次數(shù)越多，細(xì)胞變異概率越高培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式不同的激素濃度可以有選擇地誘導(dǎo)不同倍性的細(xì)胞的分裂。豌豆，低濃度2,4-D(0.25

mg/L)－－多倍體 高濃度2,4-D(20

mg/L)－－二倍體激素除了引起染色體倍性的增加外，在一些培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)染色體倍性減少的現(xiàn)象。蠶豆，無激素－多倍體發(fā)生頻率＝6.31% 10NAA，2.5KT-單倍體＝13.3％培養(yǎng)基的物理狀態(tài)以及培養(yǎng)類型也會引起細(xì)胞的變異。一般來講，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞較半固體培養(yǎng)的細(xì)胞易產(chǎn)生變異。體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)培養(yǎng)天數(shù)不同DNA值細(xì)胞比例（％）<2C2c~4c<8c8c

or

>8c088.311.7580.716.82.5134.879.56.69.1179.781.57.90.9遺傳學(xué)基礎(chǔ)–DNA在核內(nèi)重復(fù)復(fù)制－－同源多倍體硬粒小麥中胚軸培養(yǎng)中DNA值的變化體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)遺傳學(xué)基礎(chǔ)染色體斷裂與重組－－非整倍體、四倍體產(chǎn)生染色體結(jié)構(gòu)變異的一般不能正常生長

染色體畸變中出現(xiàn)的雙著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期如不能被拉斷，就會在兩核之間形成染色體橋，出現(xiàn)四倍體。體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)遺傳學(xué)基礎(chǔ)–非正常有絲分裂－－非整倍體體細(xì)胞變異除了發(fā)生在染色體水平上，更多的是在基因水平上的變異。也就是DNA水平上的堿基突變活修飾狀態(tài)的改變。DNA序列的選擇性擴(kuò)增與丟失，可能是細(xì)胞在短期內(nèi)為滿足需要而產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物的一種調(diào)控手段。體細(xì)胞變異的基礎(chǔ)分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)堿基突變DNA序列的選擇性擴(kuò)增與丟失

抗除草劑－草甘磷，3-烯醇丙酮酸莽草酸-5-磷酸合成酶轉(zhuǎn)座子活化DNA甲基化突變的類型及應(yīng)用自發(fā)突變(spontaneous

mutation)離體培養(yǎng)再生植株的自發(fā)變異比自然條件下的變異高得多，一般可高出幾百倍誘導(dǎo)突變(induced

mutation)物理誘變化學(xué)誘變復(fù)合因子誘變轉(zhuǎn)座子插入誘變誘變劑物理誘變劑化學(xué)誘變劑X,α,β,γ射線及紫外線堿基類似物誘發(fā)染色體斷裂的物質(zhì)烷化劑DNA復(fù)制中，“以假亂真”，如5-溴尿嘧啶(BU)、2-氨基嘌呤等帶有不穩(wěn)定烷基，能改變DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)。甲基磺酸乙酯馬來酰肼絲裂霉素轉(zhuǎn)座子插入誘變轉(zhuǎn)座子體系--玉米的Ac/Ds系統(tǒng)–Ac（Activation，意為活化）。相當(dāng)于一個顯性因子,它位于9號染色體長臂上,Ac與Ds（Dissociation，意為離異）隔開一段距離,但卻能遙控指揮Ds(Ds是不穩(wěn)定的，它可以從染色體的一個位點(diǎn)跳到另一個位點(diǎn))

轉(zhuǎn)座子作用：既可直接將外源基因帶入細(xì)胞內(nèi)獲得新性狀，又可以獨(dú)立插入通過其轉(zhuǎn)座功能誘導(dǎo)變異。轉(zhuǎn)座子插入誘變操作過程采用基因轉(zhuǎn)化的方法將Ac/Ds導(dǎo)入受體細(xì)胞通過體細(xì)胞培養(yǎng)或再生植株的自交或側(cè)交使

Ac因子切除，由于轉(zhuǎn)座子插入的隨機(jī)性，即可在切除Ac的植株中篩選出不同變異。

成果：已在苜蓿（顏色改變）、馬鈴薯、番茄、甘藍(lán)等多種植物上獲得可利用的體細(xì)胞變異植株。突變體的應(yīng)用創(chuàng)造育種中間材料或直接篩選新品種在全世界50多個國家中，已培育出1000多個由直接突變獲得的或由這些突變體雜交而衍生的品種通過體細(xì)胞誘變選育的谷類作物品種中，品質(zhì)得到不同程度改良的占34.3％?？共?，占誘變品種的1/4耐鹽抗除草劑耐寒耐旱突變體的應(yīng)用遺傳研究用于基因功能鑒定突變DNA序列用于分子標(biāo)記發(fā)育生物學(xué)研究用于建立器官發(fā)育模式分析鑒定一些基因的表達(dá)與植物發(fā)育的關(guān)系

在煙草、玉米中均通過質(zhì)體突變體分離鑒定了與植物葉綠體發(fā)育的基因，也可以根據(jù)需要與基因工程相結(jié)合，對一些關(guān)鍵調(diào)控過程進(jìn)行修飾和改造，使代謝過程按照人類需要進(jìn)行，因此而發(fā)展起來的新型學(xué)科領(lǐng)域稱之為代謝工程突變體的應(yīng)用生化代謝途徑研究根據(jù)需要建立某一代謝途徑中每一個調(diào)節(jié)點(diǎn)的突變體。煙草硝酸還原酶缺失突變體cnx和nia具有實(shí)用性的突變體類型

應(yīng)用抗氨基酸及類似物突變體抗病突變體抗除草劑突變體耐鹽突變體抗金屬離子突變體抗逆突變體營養(yǎng)缺陷型突變體高賴氨酸水稻突變體煙草抗野火病突變體煙草抗“毒莠定”突變體煙草已選擇出抗鹽突變體（1%~2%NaCl)抗汞、銅、鋁抗旱、抗低溫銀杏賴氨酸營養(yǎng)缺陷型突變體篩選方法直接選擇法間接選擇法綠島法正選擇法負(fù)選擇法直接選擇法正選擇法：用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在其上只有突變的細(xì)胞能夠生長，非突變細(xì)胞不能生長，從而直接篩選出突變體的辦法。小麥幼胚愈傷組織--1.4%NaCl

N6培養(yǎng)基＝＝小麥耐鹽系。900個甘薯胚性細(xì)胞系--γ射線--

2.0%NaCl==22個抗鹽愈傷組織直接選擇法負(fù)選擇法（富集選擇法，又稱濃縮法

）： –

在特定培養(yǎng)基中，讓正常細(xì)胞生長繁殖，突變體細(xì)胞受抑制不分裂呈休眠狀態(tài)，然后用一種能毒害正常生長細(xì)胞，而對休眠細(xì)胞無害的藥物淘汰正常細(xì)胞，再用正常培養(yǎng)基恢復(fù)突變體生長。該方法主要應(yīng)用于營養(yǎng)缺陷型突變體篩選。間接選擇法

間接選擇法是一種借助于與突變表現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標(biāo)的篩選方法。

當(dāng)缺乏直接選擇表型指標(biāo)或直接選擇條件對細(xì)胞生長不利時(shí)，可考慮采用間接篩選法

–如脯氨酸（Pro）錦橙珠心懸浮細(xì)胞--γ射線--高濃度Pro＝＝細(xì)胞內(nèi)Pro含量提高一倍＝＝耐寒愈傷及植株。–抗病突變體的篩選也常常用間接篩選的策略。許多重要的基因在培養(yǎng)細(xì)胞無組織、無器官的未分化狀態(tài)下并不表達(dá)，因而對這些基因突變體無法在培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。綠

島

法

綠島法是利用已分化組織進(jìn)行篩選和鑒定的方法。

對于抗病毒突變體、抗除草劑突變體的篩選，可以采用“綠島法”。

這種方法最早用于抗除草劑，葉片大面積枯黃，僅有少量抗除草劑突變細(xì)胞組織仍保持綠色，取這部分材料則成為很小的綠島，因而形象地稱之為“綠島法”。–單倍體煙草植株--γ-射線--除草劑--葉片部分變黃--取出綠色部分--愈傷組織==耐除草劑的單倍體植株==二倍體突變體篩選程序預(yù)

處

理預(yù)培養(yǎng)（懸浮或平板）誘發(fā)突變（平板培養(yǎng)）高抗高產(chǎn)細(xì)胞株選擇（平板培養(yǎng)）愈傷組織增殖或再生植株突變體鑒定小結(jié)

離體培養(yǎng)中體細(xì)胞變異發(fā)生是普遍的，但具有局限性，變異