微生物實驗(六)

微生物學(xué)實驗六指導(dǎo)教師：宋勇春本周實驗內(nèi)容實驗六：長江沿岸優(yōu)勢土壤微生物種群分析——形態(tài)、大小、數(shù)量、保存

1.細(xì)菌大小的測定（見P47——實驗八）2.微生物計數(shù)方法（見P51——實驗九）3.微生物的保存技術(shù)（見P266）【實驗?zāi)康摹?、了解目鏡測微尺和鏡臺測微尺的構(gòu)造及使用原理，掌握測定微生物細(xì)胞大小的方法。2、了解血球計數(shù)板的構(gòu)造、計數(shù)原理和計數(shù)方法，用顯微鏡直接測定微生物總細(xì)胞數(shù)。微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把10mm刻成100等分。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上(此處正好與物鏡放大的中間物像重疊)用于測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。從鏡臺測微尺上得到的讀數(shù)就是細(xì)胞的真實大小，所以用鏡臺測微尺的已知長度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測微尺每格所代表的實際長度，然后移去鏡臺測微尺，換上待測標(biāo)本，用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數(shù)下測量微生物細(xì)胞的大小。換算公式：目鏡測微尺每格長度(

m)=兩重合線間鏡臺測微尺的格數(shù)×10/兩重合線間目鏡測微尺的格數(shù)【實驗原理】測微尺的使用（1）目鏡測微尺的校正找準(zhǔn)視野、定位重合、換算實際長度。（2）細(xì)胞大小的測定稀釋、浸片、在100倍油鏡下測定、換算?！緦嶒炘怼垦蛴嫈?shù)板載玻片上中間的平臺被分隔成兩半，每個半邊上各有一個計數(shù)區(qū)(見右圖)，計數(shù)區(qū)的刻度有兩種，但都由400個小方格組成。計數(shù)區(qū)邊長為1mm，每個小方格的面積為1/400mm2；蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm3每個小方格的體積為1/4000mm3。使用血球計數(shù)板時，先測定每個小方格種微生物的數(shù)量，再換算成每ml菌液中微生物細(xì)胞的數(shù)量。（1）16×25規(guī)格的計數(shù)板換算公式：菌懸液中含有細(xì)胞數(shù)/ml＝100個小格中細(xì)胞總數(shù)/100×400×10000×菌液稀釋倍數(shù)；（2）25×16規(guī)格的計數(shù)板換算公式：菌懸液中含有細(xì)胞數(shù)/ml＝80個小格中細(xì)胞總數(shù)/80×400×10000×菌液稀釋倍數(shù)。血球計數(shù)板的使用(見下圖)（1）視待測菌懸液濃度，加無菌水稀釋。（2）滴加細(xì)菌懸液，靜置片刻后，用血球計數(shù)板計數(shù)：稀釋加樣、找計數(shù)室、計數(shù)。計上不計下計左不計右

測定的工具：目鏡測微尺鏡臺測微尺實驗5-1實驗程序（測定微生物的大?。┠跨R測微尺的校正：在高倍鏡下，看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使目鏡測微尺的0點與鏡臺測微尺的某一刻度重合，然后，仔細(xì)尋找兩尺第二個完全重合的刻度。計算兩刻度間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺的格數(shù)。由于鏡臺測微尺的刻度每格長10μm，所以可得：目鏡測微尺每格長度（μm）=（鏡臺測微尺格數(shù)×10）/目鏡測微尺格數(shù)注意：校正目鏡測微尺必須針對特定的顯微鏡和附件（特定的接物鏡、接目鏡、鏡筒長度等）進行，而且只能在這特定的情況下才可重復(fù)使用。菌體大小的測定：取下鏡臺測微尺，將細(xì)菌染色標(biāo)本置于載物臺上，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的長和寬。實驗5-2:測定微生物數(shù)量

實驗5-2實驗程序（測定微生物數(shù)量）方法：活菌計數(shù)法——平板菌落計數(shù)法；總菌計數(shù)法——血球計數(shù)板或霍瑟（PeroffHausser）細(xì)菌計數(shù)板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。

實驗程序Ⅱ1（測定微生物數(shù)量）1.取清潔無油的血球計數(shù)板，在計數(shù)室上面加蓋玻片。2.取酵母菌液，搖勻，用滴管由蓋玻片邊緣滴一小滴，使菌液自行滲入，計數(shù)室內(nèi)不得有氣泡。3.

靜止5min后，用低倍鏡觀察并將計數(shù)室移至視野中央。

4.在高倍鏡下計數(shù)：隨機計數(shù)五個中格的平均值，然后求得每個中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的總菌數(shù)，最后再換算到每mL菌液中的含菌數(shù)。實驗程序Ⅱ2

5.計算方法：

6.注意事項：壓在方格線上的菌體，以壓在底線和右側(cè)線上的菌體計入本格內(nèi)；遇到有芽體的酵母時，若芽體和母體同等大，就按單個酵母計數(shù)。

7.計數(shù)完畢后，血球計數(shù)板要立即清洗干凈，并用吸水紙吸干，最后用擦鏡紙擦干凈，并放回盒內(nèi)。

（X1+X2+X3+X4+X5）5*25（或16）*