基因表達(dá)分析技術(shù)

醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)第四章分子遺傳技術(shù)方法

基因表達(dá)分析技術(shù)METHODSFORANALYZINGGENEEXPRESSIONSpeaker：2023/10/21genemRNAProteinpolypeptidechainGeneExpression2023/10/22一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

（realtimequantitativePCR，RT-qPCR）2023/10/23實(shí)時(shí)熒光定量PCR

(realtimequantitativePCR，RT-qPCR)是熒光化學(xué)物質(zhì)與PCR產(chǎn)物相結(jié)合，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量實(shí)時(shí)PCR與普通PCR的比較

在線(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控對(duì)樣品擴(kuò)增的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，能夠?qū)崟r(shí)地觀(guān)察到產(chǎn)物的增加，直觀(guān)地看到反應(yīng)的對(duì)數(shù)期

降低反應(yīng)的非特異性使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性

增加定量的精確性全程監(jiān)控，精確定量

結(jié)果分析更快捷方便，無(wú)需電泳

熒光染料

SYBRGreenI是一種結(jié)合于雙鏈DNA（double-strand,dsDNA）

小溝中的熒光染料，游離的熒光染料不發(fā)出信號(hào)，所以開(kāi)始時(shí)檢測(cè)不到熒光信號(hào)，隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，染料不斷地與dsDNA結(jié)合而發(fā)出熒光，被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。2023/10/26非特異性熒光染料標(biāo)記：SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記：TaqMan優(yōu)點(diǎn)與特異性的熒光探針相比價(jià)格便宜

只需要設(shè)計(jì)PCR引物熒光信號(hào)強(qiáng)與其它探針相比設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單可用于多通道檢測(cè)可用于SNP的檢測(cè)缺點(diǎn)由于它和模板的結(jié)合是非特異性的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，不能真實(shí)反映目的基因的擴(kuò)增情況比DNA結(jié)合染料價(jià)格高2023/10/27Ct（thresholdvalue）值是指熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，此時(shí)熒光信號(hào)明顯高于背景熒光信號(hào)。2023/10/28Ct值與模板起始濃度的關(guān)系

模板起始濃度越高，Ct值越小

Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系

如果模板濃度增加1倍，Ct值就提前1個(gè)循環(huán)到達(dá)如果模板濃度減少1倍，Ct值就滯后1個(gè)循環(huán)到達(dá)2023/10/29相對(duì)定量（Relativequantification）是計(jì)算要處理樣本相對(duì)于正常（內(nèi)參基因）樣本的基因表達(dá)量變化，屬于倍數(shù)關(guān)系式，擴(kuò)增效率達(dá)到100%時(shí)用2-??CT法來(lái)分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還要引入一個(gè)或多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。內(nèi)參基因（Referencegene）是指在不同類(lèi)型細(xì)胞、不同實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件下恒定表達(dá)的一類(lèi)管家基因，常用的內(nèi)參基因有b-actin、GAPDH、18sRNA、efla等。2023/10/210

相對(duì)定量分析方法12-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以?xún)?nèi)。1．計(jì)算ΔCt：ΔCt=Ct靶基因－CtGAPDH，分別計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的ΔCt。2．計(jì)算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組－ΔCt對(duì)照組。3．計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的差值。2－ΔΔCt靶基因AGAPDHΔCt對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組

相對(duì)定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法

前提：目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同

待測(cè)樣品目的基因濃度

待測(cè)樣品內(nèi)參基因濃度

F=對(duì)照樣品目的基因濃度對(duì)照樣品內(nèi)參基因濃度二、基因表達(dá)分析的具體步驟1