紅豆杉多糖對(duì)心肌缺血-再灌注損傷模型心肌nadph氧化酶mrna、超氧化物歧化酶、丙二醛的影響

紅豆杉多糖對(duì)心肌缺血-再灌注損傷模型心肌nadph氧化酶mrna、超氧化物歧化酶、丙二醛的影響

心肌缺血置換術(shù)（miri）是一種由心臟外科手術(shù)發(fā)展而來(lái)的損傷機(jī)制。它的心律失常和心肌痙攣是臨床心臟病患者猝死的常見(jiàn)原因。紅豆杉多糖是本課題組首次以極性梯度提取技術(shù),從紅豆杉科植物南方紅豆杉Taxuschinensisvar.maireiChengetL.K.Fu中發(fā)現(xiàn),并采用離子交換色譜提純、非線性優(yōu)化控制模擬移動(dòng)床純化等手段得到的一種高純度全新多糖,同時(shí)應(yīng)用核磁共振等進(jìn)行了多糖分子結(jié)構(gòu)鑒定。前期研究表明紅豆杉多糖可抑制缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與降低心肌組織MCP-1蛋白表達(dá)及NO水平、抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究觀察紅豆杉多糖對(duì)MIRI模型犬心肌損傷及心肌NADPH氧化酶mRNA、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的影響。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用Beagle犬,一級(jí),30只,雌雄各半,體質(zhì)量8.0~10.5kg,8~12月齡,由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2004-15。1.2mrna及mfv、400溶液制備卡維地洛片,上海羅氏制藥有限公司產(chǎn)品,批號(hào)MH6600908;NADPH氧化酶p47phox(NCF-47K)mRNA原位雜交試劑盒,武漢博士德公司生產(chǎn);SOD測(cè)試盒,南京建成生物工程研究所生產(chǎn);MDA測(cè)定試劑盒,南京建成生物工程研究所生產(chǎn);MFV—3200電磁流量計(jì),日本光電公司生產(chǎn);HX—300S動(dòng)物呼吸機(jī),成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)。2方法2.1優(yōu)化多糖分離工藝紅豆杉多糖初提采用極性遞減的溶劑進(jìn)行分步抽提,即多糖采用模擬移動(dòng)床(SMB)連續(xù)逆流色譜對(duì)有效組分進(jìn)行純化。關(guān)鍵是選擇合適的分離介質(zhì),并采取非線性控制軟件對(duì)電磁閥的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行優(yōu)化控制。該分離工藝的關(guān)鍵是:既要把多糖等大分子物質(zhì)與萜類、甾類和生物堿類小分子物質(zhì)分開(kāi),還要把不同的多糖分開(kāi)。目前已提純分離出相對(duì)分子質(zhì)量為23000的主要多糖成分,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%,符合國(guó)家二類以上新藥的開(kāi)發(fā)要求,提取率約70%。對(duì)得到的高純度多糖成分分別用制備HPLC、質(zhì)譜、核磁共振、紅外光譜等儀器進(jìn)行綜合分析,并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,確定該多糖主要由D-葡萄糖及少量的D-木糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸以β-1,3糖苷鍵組成,在其β-1,3葡聚糖主鏈上,存在少量β-1,6糖苷鍵分支。2.2給藥劑量及給藥劑量參考《中藥新藥研究指南》中治療胸痹心痛證中藥的藥效學(xué)研究部分,將30只Beagle犬隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、紅豆杉多糖低劑量與高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組,每組6只。假手術(shù)組、模型組不給藥;紅豆杉多糖低、高劑量組分別ig給予紅豆杉多糖89.5、357mg/(kg·d),陽(yáng)性對(duì)照組給予卡維地洛1mg/(kg·d),共給藥7d。給藥結(jié)束后建立MIRI模型。2.3電磁流量計(jì)夾閉方法Beagle犬經(jīng)3%戊巴比妥鈉30mg/kgiv麻醉后,臥位固定,氣管插管,接HX—300S動(dòng)物呼吸機(jī),以呼吸比5∶4、呼吸頻率18~20次/min、潮氣量120~135mL行機(jī)械通氣。于5、6肋間開(kāi)胸,暴露肺和心臟,用撐胸器撐開(kāi)胸腔,做心包搖籃,充分暴露手術(shù)野,在左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)中下段游離約1cm,于LAD的中下1/3處確定夾閉點(diǎn),并在夾閉部位上緣附近套上合適直徑的電磁流量計(jì)卡式探頭,接MFV—3200電磁流量計(jì)。夾閉已分離的LAD主干60min(在電磁流量計(jì)監(jiān)控下使LAD血流量降低約80%),然后開(kāi)放再灌注120min。假手術(shù)組手術(shù)方法同上,但僅分離LAD,不夾閉。2.4組織病理學(xué)觀察犬處死后,取心尖附近再灌注區(qū)心肌組織,4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡(×400)觀察。2.5．型鋼參考試劑盒說(shuō)明書行原位雜交檢測(cè)。NCF-47KmRNA的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。在200×光鏡下每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,Image-ProPlus5.0.2.9軟件分析各視野NCF-47KmRNA陽(yáng)性物質(zhì)的平均吸光度值,求其平均值為每一切片NCF-47KmRNA的表達(dá)值。2.6sod、mda檢測(cè)方法每例樣本取心尖附近缺血再灌注區(qū)心肌組織約100mg,加入0.9mL冷生理鹽水冰浴勻漿后,以3000r/min離心15min,取上清液,參照SOD、MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書比色法測(cè)定。2.7統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量資料結(jié)果均以表示,采用SPSS13.0軟件分析,單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。3結(jié)果3.1miri模型建立在建立MIRI模型期間,模型組1只犬在再灌注18min時(shí)發(fā)生室顫,經(jīng)搶救無(wú)效死亡,其余犬經(jīng)電磁流量計(jì)檢測(cè)缺血前、缺血60min及再灌注60、120min時(shí)冠狀動(dòng)脈左前降支血流量(CBFLAD)顯示,MIRI模型建立成功。見(jiàn)表1。3.2各組心肌細(xì)胞回歸結(jié)果假手術(shù)組心肌組織無(wú)明顯病理變化。模型組心肌細(xì)胞嚴(yán)重紊亂、斷裂,核固縮及胞漿嗜酸性變明顯,有輕至中度充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn),少數(shù)組織有嚴(yán)重出血。紅豆杉多糖低劑量組心肌細(xì)胞紊亂、斷裂嚴(yán)重,核固縮及胞漿嗜酸性變明顯,有輕至中度充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。紅豆杉多糖高劑量組心肌細(xì)胞紊亂、斷裂程度較輕,核固縮及胞漿嗜酸性變明顯減少,部分組織仍有輕度充血、水腫?？ňS地洛組有中度心肌細(xì)胞紊亂、斷裂,核固縮及胞漿嗜酸性變?nèi)暂^為明顯,有輕度充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。3.3組ncf-84mrna表達(dá)水平的比較模型組、紅豆杉多糖低劑量組心肌NCF-47KmRNA表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01);紅豆杉多糖高劑量組、卡維地洛組NCF-47KmRNA表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05),仍高于假手術(shù)組,但無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。3.4各組著物著及卡維地洛組的比較模型組及各治療組心肌組織SOD活性較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01),紅豆杉多糖高劑量組心肌SOD活性顯著高于模型組(P<0.01)及其低劑量組(P<0.05),與卡維地洛組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。模型組及紅豆杉多糖低劑量組犬心肌組織MDA水平較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05),而紅豆杉多糖高劑量組、卡維地洛組心肌MDA水平顯著低于模型組(P<0.05),與假手術(shù)組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。4miri后氧自由基的變化紅豆杉又名紫杉、赤柏松等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),紅豆杉莖、葉、皮內(nèi)富含多種化合物,如紫杉醇、紫杉酚、紫杉?jí)A等,具有良好的抗白血病、抗腫瘤和降血糖作用。近年來(lái)本課題組在臨床上應(yīng)用南方紅豆杉基地種植的南方紅豆杉水煎劑進(jìn)行抗腫瘤治療時(shí),發(fā)現(xiàn)其能明顯改善伴隨冠心病及心肌梗死的腫瘤患者的心肌缺血癥狀。該植物水提物可縮小冠狀動(dòng)脈結(jié)扎致急性心肌梗死大鼠的心肌梗死范圍,有良好的心臟保護(hù)效果。因此本課題組對(duì)南方紅豆杉水提物的成分進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其主要成分為國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未報(bào)道的多糖類物質(zhì),進(jìn)而對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析并提出了分離、純化方法,現(xiàn)已獲得國(guó)家專利。為進(jìn)一步探索該多糖對(duì)MIRI時(shí)的心臟保護(hù)作用及其作用機(jī)制進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)研究。MIRI是心肌缺血后在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供,缺血心肌發(fā)生的更嚴(yán)重的損傷。目前認(rèn)為MIRI的發(fā)生與氧自由基大量產(chǎn)生密切相關(guān)。O2÷等氧自由基作為單電子化合物,具有很高的活性,主要攻擊生物膜上的不飽和脂肪酸,引起脂質(zhì)過(guò)氧化,使膜流動(dòng)性降低,通透性增高,損傷心肌細(xì)胞;它還可以改變呼吸鏈中復(fù)合物I、復(fù)合物III、ATP酶及腺苷轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu),使呼吸鏈活性受損;破壞質(zhì)膜上的離子泵,加劇因ATP耗竭而引起的細(xì)胞內(nèi)離子失調(diào),造成細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+超載,間接引起心肌細(xì)胞損傷。以往研究發(fā)現(xiàn)線粒體是MIRI后氧自由基的重要來(lái)源。心肌缺血時(shí),呼吸鏈末端細(xì)胞色素氧化酶被抑制,異檸檬酸脫氫酶(NAD+)被還原為還原型輔酶(NADH),將溶于膜脂質(zhì)中的O2還原,形成O2÷;再灌注時(shí),大量O2進(jìn)入灌注區(qū),通過(guò)NADH脫氫酶的作用而產(chǎn)生大量的氧自由基。最初發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶存在于吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞)中。近年來(lái)的研究表明,NADPH氧化酶亦廣泛存在于吞噬細(xì)胞以外的組織,包括心臟、肝臟、腎臟以及血管等。NADPH氧化酶是體內(nèi)重要的氧化酶,由多種亞單位構(gòu)成,包括存在于胞膜的p22phox和gp91phox構(gòu)成的異源二聚體,以及存在于胞質(zhì)中的p47phox、p67phox、p40phox、Rac2等幾種胞質(zhì)蛋白成分。在細(xì)胞因子等刺激物作用下,胞質(zhì)成分p47phox被磷酸化,然后與p67phox發(fā)生相互作用,從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上與p22phox和gp91phox構(gòu)成的異源二聚體結(jié)合,激活NADPH氧化酶,活化后的NADPH氧化酶以NADPH為遞氫體,催化NADPH與O2反應(yīng)生成O2÷。本實(shí)驗(yàn)病理學(xué)檢測(cè)顯示,模型組心肌損傷嚴(yán)重,且NCF-47KmRNA表達(dá)及MDA水平較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01),SOD活性較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01),提示MIRI過(guò)程中除線粒體途經(jīng)產(chǎn)生氧自由基外,NADPH氧化酶可能也參與了氧自由基的產(chǎn)生,心肌氧自由基清除障礙是心肌損傷的重要機(jī)制之一。紅豆杉多糖高劑量組心肌損傷較輕,且NCF-47KmRNA表達(dá)及MDA水平顯著低于模