厭氧折流板反應(yīng)器酸化過程中微生物種群演替過程的研究

厭氧折流板反應(yīng)器酸化過程中微生物種群演替過程的研究

酸化問題已成為限制厭氧反應(yīng)發(fā)展和普及的重要因素。尤其是高效厭氧反應(yīng)冠層裝置（abr）的反應(yīng)方法通常是公認(rèn)的。酸化的根在于厭氧反應(yīng)過程中產(chǎn)甲烷菌對ph值的變化高度敏感。如果厭氧反應(yīng)受到高負(fù)荷的影響，環(huán)境條件就會惡化，世代短、適應(yīng)性強的發(fā)酵酸菌迅速生長，其代謝產(chǎn)物如丙酸鈉和丁酸鈉等脂肪酸積累，降低了水的ph值，從而限制了產(chǎn)甲烷菌的活性[3.5]。近年來的研究表明，復(fù)雜有機物質(zhì)的厭氧消化由多種微生物共同作用。其中，氫產(chǎn)酸菌分解氫產(chǎn)酸菌的代謝產(chǎn)物，避免apf對apv的影響，確保apf保持快速分解率。氫消耗硫酸鈉可以降低氫消耗硫酸鈉的抑制，阻礙h-h的生產(chǎn)。在整個厭氧過程中，這兩種微生物對環(huán)境變化非常敏感，在微生物群之間的物質(zhì)交換中發(fā)揮著重要作用。目前,常用的酸化反應(yīng)器恢復(fù)技術(shù)是以快速恢復(fù)產(chǎn)甲烷菌的活性為基礎(chǔ)的,未考慮產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌與其他菌群之間的物質(zhì)傳遞關(guān)系;采用的方式主要有降低進(jìn)水有機負(fù)荷或提升堿度;恢復(fù)過程主要依賴經(jīng)驗判斷,具有較大盲目性,且耗時較長.而相關(guān)研究仍側(cè)重于探討酸化過程中產(chǎn)甲烷菌活性及數(shù)量的變化,對厭氧消化過程中擔(dān)負(fù)重要作用的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和耗氫產(chǎn)乙酸菌的研究較少,因而難以為酸化反應(yīng)器的快速恢復(fù)提供有效支撐.本研究分析了厭氧酸化過程中關(guān)鍵控制因子及微生物形態(tài)的變化,著重考察了酸化前后微生物種群的演替過程,旨在闡明酸化過程對厭氧微生物種群的影響,為采用微生物手段解決酸化問題提供依據(jù).1材料和方法1.1abr反應(yīng)器采用6隔室的ABR反應(yīng)器(圖1).反應(yīng)器總體積為16.5L,設(shè)計水力停留時間20h.進(jìn)水由計量泵連續(xù)泵入第1隔室,并從前到后依次流經(jīng)6個隔室.每個隔室大小一致,隔室內(nèi)分為下向流區(qū)與上向流區(qū).ABR反應(yīng)器正常運行時內(nèi)部懸浮生長著大量的顆粒污泥,整個裝置保持恒溫(35℃±1℃).ABR反應(yīng)器采用人工配制的葡萄糖水作為營養(yǎng)底物,正常運行時配水COD為2000mg/L,同時添加KH2PO3、NH4Cl、NH4HCO3調(diào)節(jié)COD∶N∶P=350∶5∶1,并適量補充Mg、Fe、Co、Ni等微量元素.反應(yīng)器進(jìn)水以NaHCO3調(diào)節(jié)堿度,保證進(jìn)水pH值在6.8~7.5之間.1.2測試方法1.2.1cod的氧化為研究ABR反應(yīng)器的酸化進(jìn)程,采取保持水力停留時間恒定,提高進(jìn)水負(fù)荷的方式,將進(jìn)水COD由2000mg/L直接提升到4000mg/L,其他水質(zhì)指標(biāo)保持穩(wěn)定.在較高的負(fù)荷下,反應(yīng)器逐漸由正常運行狀態(tài),轉(zhuǎn)變?yōu)檩p度酸化和完全酸化,整個酸化過程歷時2個月.1.2.2cod、vfa的測定pH監(jiān)測采用pHS-25型數(shù)顯pH計(上海金鵬分析儀器公司);COD采用CM-02型COD測定儀(北京雙暉京承電子產(chǎn)品有限公司);VFA測定采用滴定法;微生物形態(tài)表征采用Quanta200環(huán)境電子掃描顯微鏡(荷蘭FEI公司).1.3微生物群變化的fish檢測1.3.1種產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌探針的表征研究中著重分析厭氧酸化過程中具有重要作用的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌.這3種功能菌群均分支眾多,很難用1種單一探針來檢測所有的目標(biāo)微生物.因此對每1種功能菌群選用1~2種常見的探針來表征.采用Synm700、Wol223這2種探針的組合來表征產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌,其中Synm700針對Syntrophomonasspp.,用于檢測食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌,而Wol223針對Syntrophobacterwolinii,用于檢測食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌.AW針對耗氫產(chǎn)乙酸菌群中的Acetobacteriumsp.E.limosum.MG1200針對產(chǎn)甲烷菌群中的Methanomicrobiales.此外,采用EUB338檢測真細(xì)菌,采用ARCH915檢測古細(xì)菌.厭氧污泥中的發(fā)酵產(chǎn)酸菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌屬于真細(xì)菌,而產(chǎn)甲烷菌屬于古細(xì)菌.探針的詳細(xì)情況見表1.探針用熒光染料TAMRA或FITC在5′端標(biāo)記,3種熒光染料的檢測條件如表2所示.其合成和標(biāo)記均由大連寶生物公司完成.1.3.2雜交前處理及熒光顯微鏡分析新鮮的厭氧顆粒污泥樣品用4%多聚甲醛于4℃恒溫下固定過夜后,保存?zhèn)溆?雜交試驗前,樣品需超聲打散并涂于專門定制的載玻片的凹槽中.將探針儲備液溶于雜交緩沖液(0.9mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl,0.01%SDS,一定濃度的甲酰胺,每種探針的最適甲酰胺濃度通過試驗優(yōu)化確定)后滴在樣品槽中,于46℃下避光雜交2h.雜交后,迅速用雜交緩沖液洗去未雜交上的探針.最后用DAPI避光染色5min,抗淬滅封片劑封片.在OlympusBX51熒光顯微鏡下觀察、拍照,用ImageProPlus軟件分析結(jié)果[19~22].1.3.3甲酰胺最佳用量的確定雜交緩沖液中加入甲酰胺有助于促使DNA變性.研究中為了探索甲酰胺的最適用量,設(shè)計了體積濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%的梯度試驗[14~17],優(yōu)化試驗結(jié)果如表3.1.3.4形態(tài)變異微生物的數(shù)量特性采用相對豐度法表征各類微生物的數(shù)量變化.即通過雜交試驗,將雜交呈陽性的細(xì)胞與同視野下細(xì)菌總數(shù)(DAPI染色)的比值定為該類微生物的相對豐度,來間接反映某類微生物在生物群落中的數(shù)量變化.2結(jié)果與討論2.1abr氧化過程對vfa的去除效果ABR反應(yīng)器酸化過程中pH值的變化如圖2所示.正常運行時,各隔室的pH值保持在6.0~7.2之間,且從第1隔室到第6隔室pH值逐漸升高;輕度酸化時,反應(yīng)器前端隔室的pH值受到的影響較大,而后端的pH值僅降低0.2個單位,保持相對穩(wěn)定;當(dāng)輕度酸化積累到第32d時,產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌及產(chǎn)甲烷菌的活性受到較大破壞,難以有效降解水體中的VFA,反應(yīng)器pH值迅速下降到4.7以下,反應(yīng)器完全酸化.厭氧酸化對COD的影響如圖3所示.正常運行時反應(yīng)器對COD的去除率可達(dá)95.5%,其中僅前2個隔室去除率就達(dá)到79.8%,后4個隔室基本處于閑置狀態(tài);當(dāng)反應(yīng)器出現(xiàn)輕度酸化時,前2個隔室COD的去除率下降到67.2%,但第3、4隔室對COD的去除效率明顯升高,反應(yīng)器整體去除率保持92.1%左右;而隨著酸化的加劇,前端隔室對COD的去除率依次降低;至完全酸化時,整個反應(yīng)器的COD去除率僅為30.9%,且各個隔室對COD的去除貢獻(xiàn)都不大.厭氧反應(yīng)器內(nèi),VFA的變化主要來源于VFA生成和消耗之間的平衡,因而VFA是表征反應(yīng)器運行狀況的關(guān)鍵指標(biāo),ABR酸化過程對VFA的影響如圖4所示.可以看出,隨著酸化的加劇,各隔室對VFA的消耗量明顯降低,VFA在反應(yīng)器內(nèi)快速增長.正常運行時,VFA僅在第1隔室有明顯積累,而在其他隔室逐漸被降解,出水VFA僅有2.3mmol/L.輕度酸化時,VFA在各個隔室的去除率均略有降低,出水VFA達(dá)到5.8mmol/L.而嚴(yán)重酸化時,前端隔室VFA快速積累,出水達(dá)到14.1mmol/L.綜合考慮酸化過程中pH、COD和VFA的變化可知,ABR反應(yīng)器前端隔室以發(fā)酵產(chǎn)酸對VFA的積累為主;而后端隔室以產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌等微生物對VFA的消耗為主.當(dāng)進(jìn)水負(fù)荷加大時,反應(yīng)器前端隔室首先受到?jīng)_擊,發(fā)酵產(chǎn)酸菌大量繁殖,VFA的生成量明顯升高;當(dāng)VFA積累量在10mmol/L左右,產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌活性降低,但仍能夠有效去除前端產(chǎn)生的VFA,COD仍保持較高去除率,反應(yīng)器表現(xiàn)為輕度酸化;而當(dāng)VFA積累量達(dá)到接近19mmol/L時,產(chǎn)甲烷菌的活性受到抑制,導(dǎo)致乙酸和H2的積累,進(jìn)而抑制了產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的活性,導(dǎo)致丙酸和丁酸降解受阻,VFA濃度進(jìn)一步升高,由此產(chǎn)生連鎖性的抑制,造成系統(tǒng)運行失敗.可見酸化現(xiàn)象最先表現(xiàn)為前端隔室發(fā)酵產(chǎn)酸菌代謝失衡,再通過種間作用逐漸影響到后面產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌群的生長,最終導(dǎo)致厭氧系統(tǒng)整體酸化.2.2酸化前后的微生物群變化2.2.1顆粒污泥形態(tài)變化厭氧酸化顯著影響了ABR反應(yīng)器的pH、VFA等環(huán)境因子,進(jìn)而影響到厭氧顆粒污泥中微生物的表觀形態(tài).由圖5可知,正常運行時顆粒污泥表層的桿狀菌形狀均勻、整齊;內(nèi)部球菌細(xì)胞表面光滑、形態(tài)較為單一,種群生長狀況良好.酸化后,大部分表層桿狀菌細(xì)胞形態(tài)畸變,出現(xiàn)局部突起;內(nèi)部細(xì)胞殘骸顯著增多,桿菌、梭菌等其他形態(tài)雜菌大量生長.厭氧顆粒污泥具有與其功能和環(huán)境相適應(yīng)的形態(tài)結(jié)構(gòu),顆粒通常為層狀結(jié)構(gòu),其表面以發(fā)酵產(chǎn)酸菌為主,向內(nèi)逐漸轉(zhuǎn)化為以產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌為優(yōu)勢.正常狀態(tài)時,顆粒污泥整體形成一個高效的厭氧消化體系,表層發(fā)酵產(chǎn)酸菌將COD降解為VFA,VFA經(jīng)顆粒污泥微生物間的孔隙進(jìn)入顆粒污泥內(nèi)部,經(jīng)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌的協(xié)同作用,最終以CH4、CO2等氣體形式排出體系外,而外界環(huán)境改變會顯著影響微生物形態(tài).酸化后顆粒污泥形態(tài)變化顯示,酸化致使表層發(fā)酵產(chǎn)酸菌形態(tài)出現(xiàn)異常,但未影響到其生長繁殖,水解酸化過程仍可進(jìn)行;而顆粒污泥內(nèi)部的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌等大量死亡,活性明顯降低.可以看出,厭氧酸化后顆粒污泥內(nèi)部出現(xiàn)大量的微生物殘骸,這些物質(zhì)會堵塞顆粒污泥內(nèi)部,造成顆粒內(nèi)外之間傳質(zhì)困難,導(dǎo)致微生物的代謝產(chǎn)物無法及時排出,這進(jìn)一步加速了顆粒污泥內(nèi)部微生物群落結(jié)構(gòu)破壞.2.2.2真細(xì)菌和古細(xì)菌的變化真細(xì)菌和古細(xì)菌常用來表征厭氧微生物中發(fā)酵產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷菌群的整體變化.研究中基于FISH技術(shù)對真細(xì)菌和古細(xì)菌的改變進(jìn)行了表征,結(jié)果如圖6所示.可以看出,酸化前厭氧污泥中古細(xì)菌與真細(xì)菌的相對豐度比值為34.1%∶65.9%,而酸化后該比值變化為22.5%∶77.5%.可見酸化現(xiàn)象抑制了古細(xì)菌的生長,使其相對豐度減少了11.6%,但促進(jìn)了以發(fā)酵產(chǎn)酸菌為主的真細(xì)菌增長.2.2.3食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)酸菌syntrophabcderwolinii、c厭氧酸化過程中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌及產(chǎn)甲烷菌的FISH結(jié)果如圖7所示.由圖8可以看出,酸化顯著抑制了被檢測的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌群的生長活性.酸化后,食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌Syntrophomonasspp.的相對豐度由7.0%±1.7%減小到4.9%±0.7%,下降了30.9%;食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌Syntrophobacterwolinii的相對豐度由2.2%±0.4%減小到0.3%±0.1%,下降了85.5%;耗氫產(chǎn)乙酸菌E.limosum酸化前后相對豐度下降了60.0%;產(chǎn)甲烷菌Methanomicrobiales的相對豐度下降了54.3%.厭氧反應(yīng)器酸化后,發(fā)酵產(chǎn)酸菌所占比率顯著增長,而產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌的生長受到明顯抑制,這就導(dǎo)致原有的微生物種群間的物質(zhì)代謝平衡會受到進(jìn)一步嚴(yán)重破壞,VFA的積累加劇,酸化程度惡性增長.由于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌、耗氫產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)甲烷菌的世代期長,且pH值適應(yīng)范圍窄,在酸化條件下難以自然生長,最終導(dǎo)致酸化后反應(yīng)器難以自然恢復(fù).3多步多步升溫顆粒污泥表層發(fā)酵過程中cod去除率,導(dǎo)致顆粒污泥內(nèi)部產(chǎn)氫產(chǎn)酸菌活性周期,導(dǎo)致cod去除率下降,造成顆粒污泥內(nèi)部產(chǎn)氫產(chǎn)酸菌豐富,造成顆粒微生物代謝不穩(wěn)定.(1)在ABR厭氧反應(yīng)器中,酸化現(xiàn)象由前向后逐漸傳遞.輕度酸化時僅前端隔室受到?jīng)_擊,后端隔室仍具有較高COD和VFA去除能力.完全酸化時,各隔室pH值下降1.0~2.2