組織芯片檢測技術(shù)的應(yīng)用研究

組織芯片檢測技術(shù)的應(yīng)用研究

組織芯片也稱為組織微芯片，具有高效或高流量特點(diǎn)，能及時、高效、經(jīng)濟(jì)，試驗(yàn)結(jié)果具有很強(qiáng)的優(yōu)勢。因此,具有潛在的廣闊應(yīng)用前景。由于組織芯片技術(shù)是一項(xiàng)新技術(shù),其應(yīng)用價值和應(yīng)用范圍正處于深入探索階段。目前,組織芯片主要用于腫瘤研究,其巨大的潛在價值還有待進(jìn)一步開發(fā)。為了更好的認(rèn)識、利用和推廣組織芯片,有必要弄清楚哪些檢測技術(shù)可用于組織芯片,即組織芯片的基本應(yīng)用范圍。本文對HE染色、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交和熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用于組織芯片的可行性和有效性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的探索和嘗試,對組織芯片的組織形態(tài)、組化特性、蛋白和核酸(RNA和DNA)在組織細(xì)胞中的定位及分布進(jìn)行觀察,明確了組織芯片的基本應(yīng)用范圍,為進(jìn)一步探索組織芯片的多種用途奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1織芯、淋巴組織芯片正常組織芯片54組織芯,多腫瘤組織芯片60組織芯,淋巴瘤組織芯片41組織芯。所有組織均為北京友誼醫(yī)院病理科1990—2002年間以10%福爾馬林固定、石蠟包埋的外檢和尸檢檔案材料。1.2方法1.2.1免疫藥物單克隆抗體dakoHE染色采用常規(guī)HE染色方法。組織化學(xué)染色,本研究選用Masson三色染色法,具體為標(biāo)準(zhǔn)Masson染色法。免疫組化采用Dako公司生產(chǎn)的EnVision二步染色法,以及Dako生產(chǎn)的AE1/AE3、CD3、CD20單克隆抗體。4μm厚的組織芯片經(jīng)二甲苯2×10min,純乙醇2×3min,96%乙醇2×3min,70%乙醇2×3min,3%H2O210min,TBS3min,pH9.0EGTA修復(fù)液微波修復(fù)15min;室溫TBS3min,一抗(工作液)60min,EnVision30min;TBS3?min,DAB2~10min,自來水沖洗5min;Mayers蘇木精1~3min,自來水沖洗5min,水性封片膠封固。1.2.2表達(dá)tis-pcr檢測其第一抗體tki的制備采用地高辛標(biāo)記EBER1/2DNA探針,檢測組織中EB病毒編碼的小RNA(EBER1和EBER2)。具體方法:4μm厚的組織芯片經(jīng)二甲苯2×10min,純乙醇2×3min,蒸溜水2×3min;蛋白酶K80μl(Dako30042ml50mmol/LTris),蒸溜水2min;純乙醇3×2min,空氣干燥,加探針20~30μl,加蓋玻片;55℃濕盒中孵育60~90min,去掉蓋玻片;切片浸入TBS3min;3%H2O210min;TBS3min;第一抗體(anti-digoxigenin1∶30000,Sigma)60min,TBS3min;EnVision30min,TBS3minDAB2~10min,自來水沖洗5min;Mayers蘇木精1~3min,自來水沖洗5min;水性封片膠封固。1.2.3vysis法采用地高辛標(biāo)記CH7DNA探針(購自Vysis公司),檢測第7號染色體的中心粒(centromere)。具體方法:4μm厚的組織芯片經(jīng)二甲苯和純乙醇浸泡后空氣干燥,0.2mol/L鹽酸3min,Vysis預(yù)處理液(購自Vysis公司)80℃30min;2×SSC2~5min,Vysis胰蛋白酶(購自Vysis公司)37℃10min;福爾馬林固定10min,94℃變性后入梯度乙醇(70%,80%,100%)干燥;10μg/ml蛋白酶K10min,梯度乙醇(70%,80%,100%)干燥;75℃5min使探針變性,加探針,放蓋玻片,37℃過夜;0.4×SSC3min,熒光素標(biāo)記的抗地高辛抗體30min,0.2μgDAPI及antifade液復(fù)染并封固。熒光顯微鏡觀察并照相。2結(jié)果2.1he染色在所有檢查組織中,細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)呈紅色。顏色鮮艷,核漿對比清晰。細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)顯示清晰(圖1,2)。2.2小鼠腸道狀態(tài)的變化在不同的組織細(xì)胞中顯示出紅、綠、暗紅3種不同顏色。如小腸間質(zhì)和杯狀細(xì)胞呈綠色,平滑肌呈紅色,腺體呈暗紅色(圖3)。顏色對比清晰,細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)顯示清楚。2.3皮質(zhì)細(xì)胞的鑒定經(jīng)混合性細(xì)胞角蛋白AE1/AE3標(biāo)記,幾乎所有的上皮源性細(xì)胞均染上了棕黃色,所有的非上皮細(xì)胞則未被標(biāo)記(圖4,5),其染色結(jié)果清晰易辨,未見組織脫片現(xiàn)象。2.4霍奇金淋巴hrs計(jì)數(shù)結(jié)果EB病毒編碼的小RNA(EBER)陽性信號呈棕色,位于霍奇金淋巴瘤HRS細(xì)胞核內(nèi)(圖6)。亦見于部分T細(xì)胞淋巴瘤的細(xì)胞核內(nèi)。陽性和陰性細(xì)胞易辨認(rèn),沒有非特異性背景。2.5細(xì)胞內(nèi)光整第7號染色體中心粒的陽性信號呈熒光亮綠色小點(diǎn),分布在細(xì)胞核內(nèi),每個細(xì)胞內(nèi)通常有2個,有時只能見到1個(圖7)。信號清晰易辨。3組織芯片的基本應(yīng)用1986年Battifora將100多個不同的小組織包埋在一個蠟塊里,然后切片,并將切片裱于普通載玻片上,稱作多組織塊和多組織片,這是組織芯片的前身。他制備多組織片的目的是提高測試抗體的效率。20世紀(jì)90年代初西方國家如丹麥也用手工方法制出多組織片,其目的是為了測試各級病理醫(yī)師的診斷水平和進(jìn)行免疫組化的質(zhì)量檢控。1998年Kononen等采用機(jī)器(組織芯片機(jī),tissuearrayer)通過鉆洞取樣,將645個直徑0.6mm組織從不同的蠟塊轉(zhuǎn)移到一個新的蠟塊中,并井然有序地排列在一起,然后切片制成了組織芯片。他們制作組織芯片的目的是為了高效地檢測腫瘤組織中相關(guān)基因及其表達(dá),從而建立腫瘤的分子文庫。從那時起,應(yīng)用組織芯片的報(bào)道迅速增多,多數(shù)是采用熒光原位雜交技術(shù)檢測組織芯片中腫瘤的特定基因片段,也有采用免疫組化和原位雜交方法檢測組織的免疫表型和探測病毒。組織芯片的應(yīng)用范圍正在逐漸擴(kuò)展,并根據(jù)不同需要和目的制成了各種不同類型的組織芯片,如正常組織芯片、腫瘤組織芯片、腫瘤發(fā)生發(fā)展的組織芯片、腫瘤預(yù)后的組織芯片等。目前組織芯片主要用于腫瘤特異性基因的篩選和功能基因組的研究。由于組織芯片具有高效的特點(diǎn),又能根據(jù)不同需要隨意組合,因此組織芯片的應(yīng)用潛能仍很廣闊。為了更好地利用組織芯片,有必要系統(tǒng)了解組織芯片有哪些基本應(yīng)用范圍。本文從HE染色,組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交和熒光原位雜交的方法學(xué)上對組織芯片的基本應(yīng)用范圍進(jìn)行了較系統(tǒng)的探索和嘗試,結(jié)果表明這些方法應(yīng)用到組織芯片上都是可行的、有效的。通過應(yīng)用這些方法可以了解組織形態(tài)、組化特性、蛋白和核酸(RNA和DNA)在組織細(xì)胞中的定位和分布。這些是組織芯片應(yīng)用的基礎(chǔ),在此基礎(chǔ)上,人們可以根據(jù)需要,發(fā)掘組織芯片的應(yīng)用潛能。目前,組織芯片已經(jīng)在科研、試劑檢測、質(zhì)量檢查和標(biāo)準(zhǔn)化等方面得到了初步應(yīng)用。通過對組織芯片基本應(yīng)用范圍的了解,我們相信組織芯片將會在更多的領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。在掌握組織芯片基本應(yīng)用范圍的基礎(chǔ)上可以演繹出很多種用途,有的已成為現(xiàn)實(shí),如:①HE染色:其目的是展現(xiàn)組織細(xì)胞的形態(tài),據(jù)此,做成了或可以做成正常組織芯片、腫瘤組織芯片、炎性病變組織芯片、心血管疾病和神經(jīng)疾病等系統(tǒng)性疾病組織芯片、疑難疾病組織芯片、少見病組織芯片、寄生蟲組織芯片、基本病理改變組織芯片等等。這些組織芯片可用于教學(xué)、水平測試,亦可作為縮微的組織學(xué)和病理學(xué)圖譜。②組化染色和免疫組化染色:目的是了解組織細(xì)胞和病原中的組化成分或抗原表達(dá),可以根據(jù)需要做成各種組織芯片,研究各種組織細(xì)胞以及病原的表型和表達(dá),在這方面有很大的科研潛能。另一方面,可以通過已知的組織細(xì)胞和病原了解各種試劑和/或抗體的特異性和敏感性。根據(jù)需要做成各種組織芯片測試新試劑和新抗體,進(jìn)行組化染色和免疫組化染色的質(zhì)量監(jiān)控,也可用于常規(guī)組化