PCR技術原理與操作

PCR技術原理與操作主要內容核酸的種類與功能DNA復制原理PCR發(fā)展簡史PCR基本原理PCR體系各組分及作用PCR操作步驟及分析PCR技術的優(yōu)缺點脫氧核糖核酸核糖核酸核酸

核酸是細胞內攜帶遺傳信息的物質，在生物體的遺傳、變異和蛋白質的生物合成中起著極其重要的作用。１、種類２、功能簡稱DNA簡稱RNA一核酸的種類與功能3、微生物分類（按核酸類型）（1）DNA微生物：細菌、寄生蟲類（附紅細胞體、弓形體）、衣原體、支原體

DNA病毒

皰疹病毒科:偽狂犬病毒、馬立克病毒、傳染性喉氣管炎病毒和鴨瘟病毒；圓環(huán)病毒科：豬圓環(huán)病毒、雞傳染性貧血病毒；

細小病毒科:豬細小病毒、犬細小病毒、番鴨細小病毒、鵝細小病毒；痘病毒科：雞痘、山羊痘和綿羊痘；腺病毒科：減蛋綜合征病毒和犬傳染性肝炎病毒（2）RNA微生物RNA病毒

正粘病毒科：流感病毒

副粘病毒科：新城疫病毒、犬瘟熱病毒、小反芻獸疫病毒

彈狀病毒科：狂犬病病毒、牛流行熱病毒冠狀病毒科：雞傳染性支氣管炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、SARSV

黃病毒科：豬瘟、乙型腦炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒

小核糖核酸病毒科：口蹄疫病毒

披膜病毒科：豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙RNA病毒：傳染性法氏囊病毒反轉錄病毒：禽白血病、牛白血病、馬傳染性貧血病毒二DNA復制原理半保留復制1971年，Khorana提出：經過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設想被人們遺忘了……三PCR發(fā)展簡史KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個引物（而不是一個引物）去擴增模板DNA的想法…...三PCR發(fā)展簡史Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA，……1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內的DNA復制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎三PCR發(fā)展簡史四PCR基本原理類似于DNA的體內復制。首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復。模板DNA95℃PCR原理PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍四PCR基本原理1、PCR體系組分引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）五PCR體系各組分及作用（1）模板

模板作為DNA合成時的初始鏈，可以是DNA或cDNA分子，模板需要量一般為102～105拷貝。（2）擴增緩沖液

緩沖液有助于酶的穩(wěn)定，是給聚合酶提供一個最適合酶催化反應條件。10～50mmol/LTris-Hcl(pH8.3～8.8）（3）耐熱DNA聚合酶

催化PCR反應，該酶是從Thermusaquaticus細菌中提取的特殊的耐熱DNA聚合酶，可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本；具有5′→3′方向的聚合活性和外切活性。2、各要素作用五PCR體系各組分及作用美國Yellowstone公園的熱泉嗜熱水生細菌Thermusaquaticus1988年saiki從嗜熱水生菌ThermusaquaticsYT-1株中直接分離出來。該菌株于1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離到。（4）4種dNTP混合物

四種脫氧核苷酸，是DNA的原料；dNTP的通常使用濃度為20～200μmol/L。

（5）引物作為合成起始的識別點，從引物末端開始延伸，合成整條鏈。通常使用濃度為0.1-0.5mol/L（6）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。Mg2+與dNTP以及DNA模板結合形成復合體，只有這種復合體才能被DNA聚合酶識別；通常使用濃度為0.5mmol/L-2.5mmol/L。五PCR體系各組分及作用六PCR操作步驟與結果分析1、RNA/DNA提取2、RNA的反轉錄3、PCR擴增4、電泳分析產物1、RNA/DNA提?。?）異硫氰酸胍法和Trizol提取法（RNA)（2）酚-氯仿提取法和DNAzol提取法（DNA)（3）柱子提取法（4）全自動核酸提取法（1）Trizol提取RNA法：取1.5mL滅菌Eppendorf管，每管加入300μL裂解液，然后分別加入待測樣品、陰陽性對照各100μL，吸頭反復吸打混勻（一份樣品換用一個吸頭）室溫放置2-5min；再加入100μL氯仿，充分顛倒混勻（不宜過于強烈）；于4℃條件下，12000r/min離心15min。Trizol使細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。加入氯仿，有變性蛋白質的作用，主要用處是用來分相，加速有機相和水相的分層。吸取離心后各管中的上清液150μL轉移至新的1.5mL滅菌Eppendorf管中（注意不要吸出中間層，要緩慢出），加入150μL－20℃預冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置15min。異丙醇沉淀，優(yōu)點是容積小且速度快，主要沉淀核酸。（1）Trizol提取RNA法：4℃條件下12000r/min離心15min（Eppendorf管開口保持朝離心機轉軸方向放置）。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，吸干液體，不同樣品應置于吸水紙不同地方沾干。加入1mL75%乙醇，輕輕顛倒洗滌。4℃條件下12000r/min離心5min（Eppendorf管開口保持朝離心機轉軸方向放置）。輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，沾干液體，不同樣品應在吸水紙不同地方沾干。乙醇主要是洗滌異丙醇，也可以溶解一部分蛋白。(1)Trizol提取RNA法：4℃條件下12000r/min離心30s，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量將其吸干，一份樣本換用一個吸頭（注意：滴頭勿接觸沉淀），真空抽干3-5min或室溫干燥10min。不宜過于干燥，以免RNA不溶。加入11μLDEPC水，輕輕吹打混勻，溶解管壁上的RNA，2000r/min離心5s，冰上保存?zhèn)溆?。提取的RNA須在2h內進行RT-PCR擴增或放置于－70℃冰箱備用。注意事項RNA提取時，要戴口罩、手套，所用EP管、滴頭及相關容器等要清潔，用0.1%DEPC水處理12h以上再經高壓處理,烘干后方可使用。要有專用操作臺（在超凈工作臺或生物安全柜進行操作）。所有試劑應在規(guī)定的溫度儲存，使用后立即放回。異丙醇和75%乙醇要放在－20℃預冷。加樣和混勻時一份樣品要換用一個吸頭，不同樣品加同一試劑時吸頭要懸空加入，避免交叉污染。加入Trizol試劑后要作用一定時間（5min），使其充分裂解釋放RNA。吸取水相RNA時，要避免吸到中間液面（蛋白質層），從而保證RNA純度。要小心、細致、晃動及每次移液要輕。這樣做的目的：一是小心RNase的污染降解RNA；二是動作過大會破壞RNA的完整性。要勤換手套，操作過程速度要快。

(2)DNA提取樣品采集：取病死或撲殺的動物組織；活體動物可取血清、咽喉或鼻腔拭子。樣品處理：每份樣品分別處理①組織樣品處理：稱取待檢病料0.2g置組織研磨器中剪碎并研磨，加入600μL裂解液繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢病料離心后取上清100μL加入1.5mL滅菌離心管中，再加入500μL裂解液和10μL蛋白酶K，混勻后，置55℃水