醫(yī)用分子生物學 討論課 基因組DNA提取 瓊脂糖凝膠電泳 RNA提取

分子生物學討論課匯報展示

第五小組1人類基因組DNA提取2限制性核酸內切酶切割的原理、方法3瓊脂糖凝膠電泳結果分析（DNA）4瓊脂糖凝膠電泳的應用(DNA)5人類細胞質RNA提取6RT-PCR的原理、方法7瓊脂糖凝膠電泳結果分析(RNA)8瓊脂糖凝膠電泳的應用(RNA)目錄人類基因組DNA提取限制性核酸內切酶切割的原理、方法匯報人：哺乳動物的一切有核細胞都可以用來制備DNA，除特殊要求外，白細胞、肝或脾組織是最常用的材料。原始材料較少或較難獲得時（如羊水細胞），還必須經過細胞培養(yǎng)來獲得足夠量的細胞；有時為了簡便易行起見，還可以無創(chuàng)傷地采集材料，如用口腔上皮脫落細胞、發(fā)根細胞。產前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細胞或者絨毛膜細胞SDS是一種去污劑，破壞細胞膜的脂質膜；蛋白酶K是一種很強的蛋白水解酶，能消化各種蛋白質（包括糖蛋白和肽類）及脂類和胺類物質，但糖蛋白的降解物常與DNA一同沉淀下來，干擾酶的活性，消化后需要用酚、氯仿抽提純化；人類基因組DNA提取原理principle1酚能變性蛋白質而且還能將變性的蛋白質溶解在其中；（加入1/3體積的飽和NaCl溶液，也可較好地祛除細胞降解物而純化DNA，可以避免酚的污染。）氯仿也是一種有效的蛋白變性劑，它還能促進兩相的分離；DNA上清溶液再經氯仿抽提后用乙醇沉淀，分離純化的DNA。人類基因組DNA提取原理principle1人類基因組DNA提取1提取方法從全血中提取12從口腔上皮脫落細胞，發(fā)根細胞中提取人類基因組DNA提取1操作方法（全血）點細胞裂解與RNase/蛋白酶K消化1.取100μl抗凝全血置于1.5mlEppendorf離心管中，再加入100μl裂解液和20μlRNaseA/蛋白酶K液，用移液器來回吹打混勻，室于55℃溫浴35分鐘，其間來回顛倒離心管幾次，直至溶液呈水溶狀。2.加入10μl3M的NaAc(pH4.8)，隨后加入1250μl結合緩沖液，充分振蕩混勻，12，000rpm離心30秒。人類基因組DNA提取1DNA與吸附柱的結合操作3．用移液器Tip轉移上清并加入到離心吸附柱（套好收集管）中，放置1分鐘，12，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。注意：待轉移上清約1300μl，離心吸附柱容量約650μl，故需每次轉移上清650μl到離心吸附柱中，離心，倒掉收集管中的廢液，重復實驗操作步驟3。人類基因組DNA提取1DNA的純化操作4.再加入600μl洗滌緩沖液（washingbuffer）到離心吸附柱（套好收集管）中，12，000rpm離心30秒。5．重復步驟4一次，12，000rpm離心3分鐘以充分除去洗滌緩沖液。6．小心取出離心吸附柱，棄收集管，將離心吸附柱套入一個干凈的1.5mlEppendorf離心管，并加入50μl洗脫緩沖液(elutionbuffer)到離心吸附柱中(洗脫緩沖液一定要加在離心吸附柱的正中)，放置1分鐘，于12，000rpm離心30秒。7．取出Eppendorf離心管，其中便是所提取基因組NA。無水乙醇沉淀時可見白色絮狀物0.8%瓊脂糖凝聚電泳可見一基因組DNA條帶OD值測定人類基因組DNA提取實驗結果experimentalresult1飽和酚吸取時記得吸取下層的有機相乙醇沉淀時，要沿離心管壁向DNA溶液中加入無水乙醇，輕輕搖動離心管混合至體系完全均一，見白色絮狀DNA收集細胞的多少是實驗成功與否的關鍵沉淀中加入1mlSTE后，打散細胞團便于充分消化細胞人類基因組DNA提取注意事項mattersneedingattention1限制性核酸內切酶切割的原理、方法1定義限制性核酸內切酶是可以識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶。限制性核酸內切酶切割的原理、方法1限制性核酸內切酶分類根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。Ⅰ型限制性內切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性內切酶同時具有修飾及認知切割的作用Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子，然后從底物上解離。Ⅱ類中的限制性內切酶在分子克隆中得到了廣泛應用，它們是重組DNA的基礎。絕大多數Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3'），有少數酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5'-CCC↓GGG-3'）；有的切割位點在對稱軸一側，產生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端。1限制性核酸內切酶切割的原理、方法限制性核酸內切酶切割的原理、方法

限制性內切酶的作用機制1瓊脂糖凝膠電泳結果分析應用匯報人：

1、分析條帶出現拖尾原因：蛋白質沒有去除干凈2、最下端出現明亮的條帶原因：樣本中含有RNA瓊脂糖凝膠電泳結果分析

結果分析interpretationofresult2

3、條帶的粗細原因：表明提取出的DNA的多少4、條帶沒有出現原因：1）膠太濃了，DNA跑不進來2）最后洗膠的時候沖跑了瓊脂糖凝膠電泳結果分析

結果分析interpretationofresult2瓊脂糖凝膠電泳的應用21檢測疾病基因2藥物靶

3基礎生物學應用

人類基因組研究的一個關鍵應用是通過位置克隆尋找未知生物化學功能的疾病基因。這個方法包括通過患病家族連鎖分析來繪制包含這些基因的染色體區(qū)域圖，然后檢查該區(qū)域來尋找基因。瓊脂糖凝膠電泳的應用

檢測疾病基因2

基因組序列的可用性同樣允許疾病基因的旁系同源性的快速識別，對于兩個理由是有價值的。首先，旁系同源基因的突變可以引起相關遺傳疾病。通過基因組序列使用發(fā)現的一個很好的例子是色盲（完全色盲）。CNGA3基因，編碼視錐體光感受器環(huán)GMP門控通道的a亞單位，顯示在一些色盲家系中存在突變體?；蚪M序列的計算機檢索揭示了旁系同源基因編碼相應的b亞單位，CNGB3（在EST數據庫中沒有出現）。CNGB3基因被快速認定為是其他家系的色盲的原因。另一個例子是由早衰1和早衰2基因提供的，它們的突變可能導致Alzheimer疾病的的早期發(fā)生。第二個理由是旁系同源體可以提供治療敢于的機會，例子是在鐮刀狀細胞疾病或β地中海貧血的個體中試圖再次激活胚胎表達的血紅蛋白基因，它是由于β-球蛋白基因突變引起的。瓊脂糖凝膠電泳的應用

檢測疾病基因2

在過去的世紀里，制藥產業(yè)很大程度上依賴于有限的藥物靶來開發(fā)新的治療手段。最近的綱要列舉了483個藥物靶被看作是解決了市場上的所有藥物。知道了人類的全部基因和蛋白質將極大的擴展合適藥物靶的尋找。雖然，僅僅人類的小部分基因可以作為藥物靶，可以預測這個數目將在幾千之上，這個前景將導致基因組研究在藥物研究和開發(fā)中的大規(guī)模開展。瓊脂糖凝膠電泳的應用

藥物靶2

半胱氨?；兹┑氖湛s和炎癥作用，先前認為是過敏反應的慢反映物質（SRS-A），通過特定的受體介導。第二個類似的受體，CysLT2，使用老鼠EST和人類基因組序列的重組得到識別。這導致了與先前識別的唯一的其它受體有38%氨基酸一致性的基因的克隆。這個新的受體，顯示高的親和力和幾個白三烯的結合，映射在與過敏性哮喘有關的第13號染色體區(qū)域上。這個基因在氣道平滑肌和心臟中表達。作為白三烯途徑中抗哮喘藥物開發(fā)中一個重要的靶，新受體的發(fā)現有明顯的重要的作用瓊脂糖凝膠電泳的應用

藥物靶2

人體基因組圖譜是全人類的財產，這一研究成果理應為全人類所分享、造福全人類，這是參與人類基因組工程計劃的各國科學家的共識。值得關注的是，目前在人類基因組研究領域，出現了一些私營公司爭相為其成果申請專利的現象。美國塞萊拉基因公司曾表示，想把一部分研究成果申請專利，有償提供給制藥公司。瓊脂糖凝膠電泳的應用

基礎生物學2

找到了一批主宰人體疾病的重要基因如：肥胖基因、支氣管哮喘基因。這類基因的新發(fā)現每年都有新報道。這些基因的發(fā)現，增進了人們對許多重要疾病機理的理解，并且推動整個醫(yī)學思想更快的從重治療轉向重預防。例如：湖南醫(yī)科大學夏家輝教授組于1998.5.28發(fā)表克隆了人類神經性高頻性耳聾的致病基因（GJB3），這是第一次在中國克隆的基因。瓊脂糖凝膠電泳的應用

基礎生物學2人類細胞質RNA提取RT-PCR的原理、方法匯報人：人類細胞質RNA提取3真核細胞細胞質中總RNA主要由rRNA、tRNA和核內小分子RNA、mRNA組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細胞質中。人類細胞質RNA提取3一般步驟

破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA破碎：可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織加入β-ME可以抑制RNA酶活性分離：一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。沉淀：一般用乙醇、3MNaAc（pH-5.2）或異丙醇。洗滌：使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。溶解：一般使用TE。保存：應該盡量低溫人類細胞質RNA提取具體操作operation33分析不同發(fā)育時期基因的表達狀況獲得新基因研究基