基因工程7 克隆基因的表達(dá)

第七章克隆基因的表達(dá)7.1基因表達(dá)的含義

生物的遺傳信息是以基因的形式儲存在DNA分子上的，將DNA分子所承載的遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)橛商囟ò被犴樞驑?gòu)成的多肽或蛋白質(zhì)分子的過程，即為基因的表達(dá)(geneexpression)?；虮磉_(dá)的過程為：利用各種先進(jìn)的基因?qū)爰夹g(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)方法已實(shí)現(xiàn)了外源基因在動(dòng)植物及酵母等真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)。利用真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是：

(1)能識別和除去外源基因中的內(nèi)含子，加工形成成熟的mRNA，即帶內(nèi)含子的天然基因是可以利用的；(2)真核細(xì)胞將表達(dá)的蛋白糖基化，而大腸桿菌表達(dá)的蛋白是無糖基化的，糖基化對某些表達(dá)蛋白的免疫原性影響很大。真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)尚存在以下幾個(gè)問題：(1)

轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的效率低；(2)

表達(dá)效率不夠高；(3)

細(xì)胞培養(yǎng)(動(dòng)植物)工藝較復(fù)雜，成本高；(4)

選擇標(biāo)記及選擇系統(tǒng)較少?？傮w而言，真核細(xì)胞作為表達(dá)宿主尚不成熟，有待于進(jìn)一步發(fā)展、完善。目前普遍采用原核生物作為表達(dá)宿主，原核生物(大腸桿菌)繁殖速度快，培養(yǎng)簡單，因此一些用傳統(tǒng)和常規(guī)方法不能或難以大量生產(chǎn)的有生理活性的蛋白，如果采用“工程菌”來生產(chǎn)就方便得多。7.2外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的基本條件

1.基因的編碼區(qū)域內(nèi)必須無插入序列（無內(nèi)含子），因?yàn)樵思?xì)胞中缺乏拼接加工系統(tǒng)；2.基因必須置于大腸桿菌啟動(dòng)子的控制之下，并能有效地為大腸桿菌RNA聚合酶所識別和轉(zhuǎn)錄；3.所生成的mRNA必須穩(wěn)定，且轉(zhuǎn)譯效率高；4.表達(dá)產(chǎn)物不會被宿主細(xì)胞的蛋白酶迅速降解。7.3影響基因表達(dá)的主要因素7.3.1轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄是指遺傳信息從DNA分子轉(zhuǎn)移到RNA分子的過程，是以DNA分子中的一條鏈（有意義鏈、轉(zhuǎn)錄鏈）為模板，在轉(zhuǎn)錄酶的催化下，進(jìn)行的一種聚合反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄酶即依賴于DNA的RNA聚合酶。大腸桿菌的RNA聚合酶由不同亞基(

2

’ω)組成，分子量約46萬。完整的RNA聚合酶，即

2

’ω

，稱為全酶(holoenzyme)；沒有

亞基的RNA聚合酶稱為核心酶(coreenzyme)。

亞基(

因子)容易同核心酶解離，其功能是使核心酶能穩(wěn)定地結(jié)合到DNA的啟動(dòng)子上，故又稱為起始因子。真核生物有三種不同的RNA，因而其RNA聚合酶也有三種，分別參與不同類型的RNA分子的合成。由RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過程可分為起始、延長和終止三個(gè)步驟。7.3.1.1啟動(dòng)子標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄起始的位點(diǎn)稱啟動(dòng)子。在大腸桿菌中，啟動(dòng)子被RNA聚合酶的

因子所識別。啟動(dòng)子是一段DNA序列，常位于基因或操縱子編碼順序的上游，RNA聚合酶結(jié)合在上面。1.原核細(xì)胞的啟動(dòng)子原核細(xì)胞的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游有兩個(gè)高度保守的區(qū)域：(1)位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約10個(gè)bp的

10區(qū)域，TATAAT序列(pribnowbox)，也稱

10序列。

10序列的實(shí)際位置在不同的啟動(dòng)子中略有變動(dòng)，其不同堿基的出現(xiàn)頻率為：T89A89T50A65A65T100。

10序列有助于DNA局部雙鏈解開，因?yàn)?/p>

10序列含有較多的A-T對，所以雙鏈分開所需的能量較低。(2)中心約在

35位置的TTGACA序列，也稱為

35序列或識別區(qū)。各堿基出現(xiàn)的頻率為：T83T83G81A61C69A52。

35序列提供RNA聚合酶識別的信號。這兩個(gè)區(qū)域?qū)τ跊Q定啟動(dòng)子的強(qiáng)度非常重要，事實(shí)上很小的差異對啟動(dòng)子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的效率有重大影響。一般啟動(dòng)子序列與保守序列相似程度越高，啟動(dòng)子就越強(qiáng)。

強(qiáng)啟動(dòng)子是能維持高頻率轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，通常控制那些細(xì)胞需要其大量轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄；而弱啟動(dòng)子具有相對較低的轉(zhuǎn)錄效率，指導(dǎo)那些僅需要其少量轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)錄。利用基因工程技術(shù)，可將由弱啟動(dòng)子所控制的基因放在強(qiáng)啟動(dòng)子的下游，從而獲得高效表達(dá)。兩個(gè)保守區(qū)之間的DNA對啟動(dòng)子的功能也有影響，各啟動(dòng)子都需要一些最適的間隙，通常認(rèn)為間隙為17bp的啟動(dòng)子功能較強(qiáng)。2.真核細(xì)胞啟動(dòng)子中可以找到三個(gè)保守區(qū)：(1)位于

12至

32bp之間的TATA框，序列為TATAATATA，其功能可能為DNA雙鏈開始解開并決定轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)位置。(2)位于

70至

80bp區(qū)域的CAAT框，序列為GGTCAATCT，其主要作用可能與RNA聚合酶的結(jié)合有關(guān)。(3)位于更上游約

70至

100bp處的GC框，序列為GGGCGG，也稱為增強(qiáng)子（enhancer），其作用為促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，對基因的表達(dá)可產(chǎn)生顯著的增強(qiáng)作用。增強(qiáng)子有時(shí)位于基因3’端下游區(qū)或在內(nèi)含子中。真核生物的啟動(dòng)子極為復(fù)雜，不同啟動(dòng)子之間的差異較大。例如5srRNA基因，啟動(dòng)子在基因下游，且在基因內(nèi)部：

又如爪蟾tRNAMet基因，啟動(dòng)子分成兩部分：真核生物與原核生物的基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯過程均有明顯差異，大腸桿菌的RNA聚合酶不能識別動(dòng)物啟動(dòng)子順序，真核細(xì)胞的啟動(dòng)子在原核細(xì)胞中功能很差，所以要得到真核細(xì)胞蛋白的有效表達(dá)，應(yīng)將真核基因放在原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子控制之下。3.常用于表達(dá)載體的啟動(dòng)子：(1)PLac：乳糖啟動(dòng)子，是控制LacZ基因轉(zhuǎn)錄的序列。Lac啟動(dòng)子可被IPTG誘導(dǎo)，加入該試劑到培養(yǎng)基后，將使表達(dá)載體中Lac啟動(dòng)子下游插入的基因開始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)產(chǎn)物為包含

-半乳糖苷酶的融合蛋白。(2)Ptrp：色氨酸啟動(dòng)子，通常是編碼參與色氨酸生物合成過程中的幾種酶的基因簇上游序列。trp啟動(dòng)子被色氨酸抑制，但易被

-吲哚丙烯酸誘導(dǎo)，也可用色氨酸饑餓誘導(dǎo)，所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于PLac表達(dá)載體系統(tǒng)。(3)PL：

噬菌體左向啟動(dòng)子，負(fù)責(zé)

DNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子之一。PL是一種可被大腸桿菌RNA聚合酶識別的強(qiáng)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子被

cI基因產(chǎn)物所抑制，用

PL構(gòu)建的表達(dá)載體上結(jié)合一個(gè)溫敏型

阻遏物基因（

cI857），在較低溫度（低于30℃）下cI蛋白可抑制PL，在較高溫度（42℃）時(shí)cI蛋白失活，導(dǎo)致克隆基因的轉(zhuǎn)錄。(4)Ptac：由Ptrp和PLac雜合而成，啟動(dòng)效果比二者均強(qiáng)，仍可被IPTG誘導(dǎo)。目前市售的Ptac有兩類（PtacI和PtacII）。7.3.1.2終止子提供轉(zhuǎn)錄停止信號的DNA序列稱為終止子，它可被RNA聚合酶識別并停止合成mRNA。通常終止信號是一小段DNA片段，它的RNA轉(zhuǎn)錄本上堿基對可自身相互配對形成柄-環(huán)結(jié)構(gòu)。目前已檢測了20多種終止序列，一般特性為：(1)有一個(gè)逆向重復(fù)的堿基序列，可表示為：ABCDEF-XYZ-F’E’D’C’B’A’，其中A和A’，B和B’等均為互補(bǔ)堿基對，故可發(fā)生鏈內(nèi)的堿基配對（轉(zhuǎn)錄時(shí)雙鏈解開），在RNA轉(zhuǎn)錄本上形成柄-環(huán)（stemandloop）結(jié)構(gòu)。(2)臨近環(huán)端的假柄區(qū)段（有時(shí)完全在柄內(nèi)）的G+C堿基含量豐富。(3)終止序列有時(shí)存在高A+T區(qū)段（有時(shí)不存在這種區(qū)段），這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的RNA，則會產(chǎn)生出6~8個(gè)U堿基（U末端序列）。終止子有兩種不同的類型，一種只取決于DNA的堿基順序，另一種需要

終止蛋白質(zhì)的參與。依賴于

蛋白質(zhì)的終止反應(yīng)，對一些調(diào)節(jié)機(jī)理而言是十分重要的。協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子(蛋白質(zhì))稱為終止因子(terminationfactors)。有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，這稱為通讀(readthrough)，這類引起抗終止作用的蛋白質(zhì)叫抗終止子因子(antiterminationfactors)。在克隆基因的末端，存在一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是十分重要的，這是因?yàn)椋?1)若干非必需的轉(zhuǎn)錄本的合成，會使細(xì)胞消耗巨大的能量，用于制造大批不必要的蛋白質(zhì)；(2)在轉(zhuǎn)錄本上有可能形成一些不希望其出現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu)，從而降低轉(zhuǎn)譯效率；(3)有時(shí)會出現(xiàn)啟動(dòng)子阻塞現(xiàn)象，克隆基因啟動(dòng)子所開始的轉(zhuǎn)錄，有時(shí)會干擾另一個(gè)必要的基因或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在，可使上述這幾種不利的現(xiàn)象得以避免。7.3.2轉(zhuǎn)譯（翻譯）mRNA

蛋白的過程。原核生物的轉(zhuǎn)譯過程包括多肽鏈合成的起始、延長和終止三個(gè)步驟。

1.轉(zhuǎn)譯起始序列mRNA有效地轉(zhuǎn)譯依賴于mRNA的穩(wěn)定性及結(jié)合到核糖體上的能力。大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)是轉(zhuǎn)譯的起始密碼子及SD序列，要獲得良好的表達(dá)，關(guān)鍵是起始密碼子以及SD序列必須處在易接觸的部位。細(xì)菌的起始密碼子（initiationcodon,initiator）通常是AUG，它轉(zhuǎn)譯為n-甲?；琢虬彼?；少數(shù)情況下是GUG，轉(zhuǎn)譯為纈氨酸。真核生物的起始密碼子總是AUG，并轉(zhuǎn)譯為甲硫氨酸（其在DNA中的相應(yīng)順序?yàn)锳TG）。所謂SD序列是由Shine-Dalgarno首先提出，為細(xì)菌核糖體有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯起始所需要的序列。它以不同長度（3~9個(gè)bp）組成，包含5’-UAAGGAGGU-3’的全部或其中的一部分，位于mRNA5’-末端不轉(zhuǎn)譯的前導(dǎo)區(qū)段內(nèi)，其起點(diǎn)距轉(zhuǎn)譯起始密碼子AUG約3~11個(gè)堿基。這個(gè)SD序列與16s核糖體RNA的3’-末端堿基AUUCCUCCACUAG（反SD序列）互補(bǔ)，控制轉(zhuǎn)譯的起始。2.影響mRNA轉(zhuǎn)譯效果的因素：(1)

SD序列與反SD序列的互補(bǔ)程度：互補(bǔ)程度高，則表達(dá)強(qiáng)。(2)SD序列與AUG之間的間隔距離(spacer)，使用不同的啟動(dòng)子，表達(dá)不同的基因，其最佳間隔不一樣。(3)

–20bp到＋13bp這一段序列中不要有二級結(jié)構(gòu)（發(fā)卡結(jié)構(gòu)）。(4)

連接在SD序列后面的4個(gè)堿基的改變，會對轉(zhuǎn)譯效率發(fā)生很大的影響，如果這個(gè)區(qū)域由4個(gè)A組成，其轉(zhuǎn)譯作用最為有效；而當(dāng)其被4個(gè)C或G替代，則轉(zhuǎn)譯效率僅為最高值的25~50%。(5)

直接位于起始密碼子AUG左側(cè)的堿基三聯(lián)體的組成，對轉(zhuǎn)譯效率也有重要影響，以

-半乳糖苷酶mRNA的轉(zhuǎn)譯為例，三聯(lián)體為UAU或CUU時(shí)，轉(zhuǎn)譯最有效，而若為UUC或UCA時(shí)，則轉(zhuǎn)譯水平下降20倍。(6)在起始密碼子AUG后面的核苷酸序列對核糖體結(jié)合也有一定影響。

3.轉(zhuǎn)譯后的修飾與加工在很多情況下，由mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，最初合成的肽鏈需經(jīng)過轉(zhuǎn)譯后的加工和修飾才能成為有活性的功能蛋