當歸酰天芥菜定對-L1210-HepG2和HCC細胞的抑制作用

當歸酰天芥菜定對L1210，HepG2和HCC細胞的抑制作用【摘要】目的:研究當歸酰天芥菜定的抗腫瘤活性及機制.方法：通過細胞生長曲線的繪制，分析AH對L1210細胞的抑制作用；通過MTT比色法，測定AH對L1210，HepG2和HCC細胞的抑制率；通過流式細胞術檢測AH對L1210細胞周期的影響.結果：在AH作用下，L1210細胞生長曲線斜率和最大生長密度降低.AH80mg?L-1對L1210細胞的抑制率為%；AH320mg?L-1對HepG2和HCC細胞抑制率分別為%和%.FCM檢測表明，AH80mg?L-1作用24h后，L1210細胞的G2M期細胞明顯增加.結論：AH對L1210細胞有一定的抑制作用，對HepG2和HCC細胞抑制作用較差.AH對L1210細胞的抑制作用發(fā)生在細胞周期的G2M期.

【關鍵詞】當歸酰天芥菜定；L1210細胞；HepG2細胞；HCC細胞；MTT法；流式細胞術；細胞周期

0引言

菊科狗舌草屬植物狗舌草在民間被用于治療白血病［1］.陳進軍［2］研究發(fā)現，狗舌草600mL?L-1乙醇提取物對L1210細胞有抑制作用，并推斷該作用可能來自狗舌草中含有的生物堿等成分.為了進一步弄清狗舌草的有效成分，我們對狗舌草的生物堿成分進行了分離和鑒定，并研究了狗舌草中主要生物堿當歸酰天芥菜定對白血病L1210及肝癌HepG2和HCC細胞的作用，現報告如下.

1材料和方法1材料植物材料狗舌草于199908采自陜西省隴縣關山牧場，經西北農林科技大學生命科學學院植物研究所高級實驗師楊金祥予以鑒定.經過溶劑萃取、硅膠柱層析和制備性薄層層析從狗舌草中分離得到AH；薄層層析和氣相色譜質譜聯用檢測，AH為純凈的單體化合物；質譜、紅外光譜及核磁共振碳譜對AH的結構進行了確認(Fig1).L1210，HepG2和HCC細胞由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供.酶聯免疫檢測儀，DG5031型，國營華東電子管廠；流式細胞儀，EpicsELITEESP型，Coulter公司.MTT和DMSO，Sigma產品；RPMI1640培養(yǎng)基，Gibco產品；其余試劑為國產分析純.

圖1當歸酰天芥菜定的結構(略)2方法生長曲線繪制取對數生長期的L1210細胞調密度至6×106?L-1，接種于培養(yǎng)瓶內，50mL?L-1CO2,37℃培養(yǎng).24h后加入用生理鹽水稀釋的AH，使其終濃度分別為40,80,160和320mg?L-1，另設一個生理鹽水對照組.重復1次.從加藥之日起連續(xù)記數7d，繪制出生長曲線.法測抑制率將L1210細胞調密度至1×106?L-1，96孔培養(yǎng)板每孔加入細胞120μL；HepG2細胞調密度至5×108?L-1，每孔加入200μL；HCC細胞調密度至5×107?L-1，每孔加入200μL.培養(yǎng)24h后，加入AH，使其終濃度分別為80,160和320mg?L-1，每種細胞、每個濃度平行處理3孔，另設生理鹽水對照組及只加培養(yǎng)液不加細胞的調零孔.培養(yǎng)2d后，加入5g?L-1MTT，每孔20μL，再培養(yǎng)4h后，小心抽出培養(yǎng)液，加入200μLDMSO，振蕩，10min后，490nm酶聯免疫儀比色，經調零孔調零，測吸光度值.抑制率=［/對照組A值］×100%.流式細胞術檢測細胞周期取對數生長期的L1210細胞5×105個，用培養(yǎng)液配為9mL，培養(yǎng)24h后，加入1mLAH，AH終濃度為80mg?L-1，繼續(xù)培養(yǎng).24h后，將細胞離心，PBS洗滌2次，700mL?L-1冷乙醇固定，4℃冰箱過夜.送檢前用PBS洗2次，DNAprepkit染色20min，流式細胞儀檢測.每個樣品計數2×105個細胞，經PhoenixMulticycle軟件處理.

統(tǒng)計學處理:以上各方法所得數據，在判斷試驗組和對照組差異是否顯著時，采用t檢驗進行處理.

2結果

AH各濃度組的生長曲線均在生理鹽水組右下方，斜率和最大生長密度降低，顯示了AH對L1210細胞的抑制作用(Fig2).利用MTT法測得生理鹽水對照組及AH各濃度組的A值和抑制率，對L1210細胞，AH80,160及320mg?L-1與生理鹽水對照組的A值差異極顯著，其抑制率分別為%,%和%；對HepG2及HCC細胞，AH80mg?L-1和160mg?L-1與對照組無顯著差異，320mg?L-1與對照組差異極顯著，該濃度對HepG2和HCC細胞抑制率分別為%和%.AH80mg?L-1作用24h后，L1210細胞與對照組相比，G2M期細胞增多，出現G2M周期阻滯.

圖2加入AH后L1210細胞生長曲線(略)

表1AH對腫瘤細胞的抑制率(略)

圖3對照組L1210細胞的細胞周期(略)

3討論

從以上結果可看出，AH對L1210細胞有一定的抑制作用，80mg?L-1濃度可產生作用.AH對HepG2和HCC細胞抑制作用較差，只在濃度320mg?L-1

圖4AH80mg?L-1組L1210細胞的細胞周期(略)

時才有作用.實驗證實了AH是狗舌草抗白血病細胞的有效成分之一.

在細胞生長周期中，存在著兩個調節(jié)細胞周期正常進行的關鍵點，即G1S和G2M期，腫瘤細胞抑制劑通常在這兩個時期對腫瘤細胞發(fā)揮抑制作用，如殺爾威辛對K562細胞［3］、CyclinD1反義核酸對A375細胞［4］、木黃酮對人垂體腺瘤細胞［5］及全反式維甲酸對SMMC7721細胞［6］和QBC939細胞［7］的抑制作用發(fā)生在G1S期，而姜黃素(Curcumin)可將SMMC7721細胞和人口腔鱗癌細胞阻斷在S/G2M期［8］，逆轉錄酶抑制劑阻斷HO8910細胞于G2M期［9］.本研究發(fā)現，AH對L1210細胞生長周期的阻滯發(fā)生在G2M期，這可能是其抑制L1210細胞生長的作用機制.從結構上講，AH屬于雙稠吡咯啶生物堿，部分PAs具有抗腫瘤活性和肝臟毒性.當PAs具有大環(huán)雙酯結構和烯丙醇酯結構時，毒性較大，而AH不具有這樣的結構，預計其毒性較小，確切情況尚須研究證實.

【參考文獻】

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