6-第六章-外源化學(xué)物的一般毒性作用解讀課件

10/6/20231第六章一般毒性作用10/5/20231第六章一般毒性作用1第六章、一般毒性作用§1概述§2急性毒性作用§3局部毒性作用§4短期、亞慢性和慢性毒性作用第六章、一般毒性作用§1概述2掌握一般毒性作用的概念、實驗?zāi)康氖煜ひ话愣拘栽囼灧椒ㄒc10/6/20233急性毒作用：概念、試驗?zāi)康?、試驗方法的要點、分級和評價局部刺激：試驗?zāi)康摹⒃囼烆愋投唐凇喡院吐远拘宰饔茫焊攀?、研究方法、結(jié)果評價掌握一般毒性作用的概念、實驗?zāi)康?0/5/20233急性毒作3毒性作用一般毒性作用--基礎(chǔ)毒性（急性毒性、重復(fù)劑量毒性、亞慢性毒性、慢性毒性）特殊毒性作用（致突變作用、致癌作用、致畸作用、生殖發(fā)育毒性）第一節(jié)、概述毒性作用一般毒性作用--基礎(chǔ)毒性特殊毒性作用（致突變作用、致4基本概念一般毒性作用(generaltoxicity)，又稱基礎(chǔ)毒性(basictoxicity)，是指外源化學(xué)物在一定劑量、一定接觸時間和接觸方式下對試驗動物產(chǎn)生的綜合毒效應(yīng)。根據(jù)接觸毒物的時間長短，可分為：急性毒性

→急性毒性實驗亞急性毒性（重復(fù)劑量毒性）→重復(fù)劑量毒性實驗亞慢性毒性

→亞慢性毒性實驗慢性毒性

→慢性毒性實驗重要基本概念一般毒性作用(generaltoxicity)，又5一般毒性試驗項目一般毒性測試污染物理化特性了解毒性大小和特征確定閾和閾下劑量了解對機體毒作用靶點和指標(biāo)急性毒性試驗亞慢性毒性試驗慢性毒性試驗重復(fù)劑量毒性試驗致死試驗非致死試驗3個月及以內(nèi)3-6個月6個月至終身一般毒性試驗項目一般毒性測試污染物理化特性了解毒性大小和特征66-第六章--外源化學(xué)物的一般毒性作用解讀課件7一般毒性評價一般毒性評價的主要目的：確定受試物毒作用表現(xiàn)和性質(zhì)確定受試物毒作用的劑量-反應(yīng)關(guān)系確定毒作用的靶器官確定損害的可逆性一般毒性評價：(evaluationforgeneraltoxicity)按接觸化學(xué)毒物時間長短而進(jìn)行哺乳動物試驗以觀察毒效應(yīng)、評價化學(xué)毒物綜合毒性的試驗，根據(jù)試驗結(jié)果對化學(xué)毒物的毒性進(jìn)行評價稱為一般毒性評價。一般毒性評價一般毒性評價的主要目的：一般毒性評價：(eval8一般毒性評價的意義1．是毒理學(xué)工作中非常重要的內(nèi)容；2．是化學(xué)物毒理學(xué)安全性評價和危險度評定的基礎(chǔ)；3．對防治化學(xué)毒物急、慢性中毒，制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)以及管理毒理學(xué)的決策方面有重要意義。重要一般毒性評價的意義1．是毒理學(xué)工作中非常重要的內(nèi)容；重要9一、急性毒性和急性毒性試驗的目的二、急性毒性試驗方法、要點經(jīng)典急性毒性試驗急性毒性替代實驗急性毒作用觀察三、急性毒性分級10/6/202310急性毒性作用第二節(jié)急性毒性作用一、急性毒性和急性毒性試驗的目的10/5/202310急性毒10急性毒性(acutetoxicity)：是指機體(人或試驗動物)一次接觸或24小時內(nèi)多次接觸化學(xué)物后在短期(最長到14天)內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)，最主要的觀察指標(biāo)是LD50。24小時多次：國內(nèi)規(guī)定24h內(nèi)一般不超過3次。10/6/202311急性毒性作用重要急性毒性(acutetoxicity)：是指機體(人或試驗11急性接觸的次數(shù)：一次或24小時內(nèi)多次“一次接觸”是含有時間因素的。經(jīng)口接觸和各種注射接觸，“一次接觸”，是指在瞬間將受試化合物輸入實驗動物的體內(nèi)；而經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次接觸”是指在一個特定期間內(nèi)實驗動物持續(xù)地接觸受試化合物的過程;“多次”是指當(dāng)化學(xué)物毒性很低，需要給予動物較大劑量時，可在24小時內(nèi)分多次給予(一般不超過3次)。

急性接觸的次數(shù)：一次或24小時內(nèi)多次122.中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時間:短期內(nèi)“一次或24小時內(nèi)多次接觸”后所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。觀察時間一般為7天-14天，如有必要可延長至14天以上。3.中毒效應(yīng)的強度：與亞慢性、慢性中毒相比，一般行為、外觀、大體形態(tài)的改變十分明顯，中毒癥狀嚴(yán)重，常常發(fā)生死亡。2.中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時間:短期內(nèi)13①求出LD50以及其它的急性毒性參數(shù)，了解急性毒作用強度。②通過觀察動物中毒表現(xiàn)和死亡的情況，初步評價受試物對動物的毒性和對人體產(chǎn)生損害的危險性大小、毒效應(yīng)特征、靶器官和劑量—反應(yīng)關(guān)系等急性中毒資料。③為亞慢性、慢性毒性作用試驗的染毒劑量設(shè)計提供參考依據(jù)。④為毒理學(xué)機制研究提供初步線索。

10/6/202314急性毒性作用急性毒性試驗的目的:重要①求出LD50以及其它的急性毒性參數(shù)，了解急性毒作用強度。114常用的急性毒性參數(shù)：LD50/LC50急性毒作用帶（Zac=LD50/Limac）

LD100/LD01(或LC100／LC01)

劑量—反應(yīng)曲線斜率

10/6/202315急性毒性作用常用的急性毒性參數(shù)：10/5/202315急性毒性作用15（一）LD50

(或LC50)

：是急性毒性評價中重要的參數(shù)，是比較不同化學(xué)毒物急性毒性的重要基礎(chǔ)。

局限：LD50(或LC50)的測定受許多因素的影響；不能反映化學(xué)毒物致死作用的中毒特征；LD50波動性很大。（一）LD50(或LC50)：是急性毒性評價中重要的參數(shù)16（二）其他指標(biāo)1.急性毒作用帶

（Zac=LD50/Limac）：可反應(yīng)急性閾劑量距離LD50的寬窄，即表示引起實驗動物的死亡劑量與最低毒作用劑量之間劑量范圍的寬窄。其越大，表示化學(xué)物引起急性死亡的危險性越小。2.LD84/LD16(或LC84/LC16)：靈敏性好、重復(fù)性強而且容易求。3.LD100、LD014.劑量反應(yīng)曲線斜率

（二）其他指標(biāo)17死亡率死亡率%（概率100單位）

A

B

C50

劑量（mg/kg）

圖兩種化學(xué)物的毒性比較死亡率18LD50只能說明某毒物引起受試動物半數(shù)死亡的劑量，不能反應(yīng)毒物致死作用的中毒特征。當(dāng)兩種毒物L(fēng)D50相等時，要正確評價毒物致死中毒特征，需利用劑量-死亡曲線斜率。A和B的LD50相等，但劑量-反應(yīng)曲線斜率不同，在低濃度劑量下，B毒性大；高劑量下，A毒性大。C毒性最低LD50只能說明某毒物引起受試動物半數(shù)死亡的劑量，不能反應(yīng)毒19急性毒性試驗可以得到的毒性參數(shù)：①絕對致死劑量或濃度(LD100或LCl00)②半數(shù)致死劑量或濃度(LD50或LC50)③最小致死劑量或濃度(MLD，LD01或MLC，LC01)④最大耐受劑量或濃度(MTD，LD0或MTC，LC0)或稱為最大非致死劑量(MNLD)⑤急性毒性LOAEL(觀察到有害作用的最低劑量)⑥急性毒性NOAEL(未觀察到有害作用的劑量)急性毒性的下限參數(shù)非致死性急性毒性作用為終點急性毒性的上限參數(shù)以死亡為終點通過病理組織學(xué)和中毒癥狀觀察等手段測定

急性毒性試驗可以得到的毒性參數(shù)：①絕對致死劑量或濃度(LD1201.試驗動物的選擇原則①化學(xué)毒物的代謝和毒效應(yīng)表現(xiàn)與人的反應(yīng)盡可能一致的試驗動物。②動物易于獲得③品系純化④價格較低和易于飼養(yǎng)等條件。檢疫10/6/202321急性毒性作用(一)

經(jīng)典的急性毒性試驗1.試驗動物的選擇原則10/5/202321急性毒性作用(一211）．試驗動物的種屬和品系最好用兩個種屬的動物嚙齒類（為主）:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非嚙齒類：狗或猴。急性皮膚毒性試驗：成年大鼠、豚鼠或家兔，優(yōu)先考慮白色家兔。急性吸入和經(jīng)口急性毒性試驗：大鼠（優(yōu)先）、小鼠10/6/202322急性毒性作用經(jīng)典的急性毒性試驗1）．試驗動物的種屬和品系10/5/202322急性毒性作用222）試驗動物的年齡和體重：急性試驗動物不宜過老或過幼，通常未曾交配和受孕的剛成年動物：大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、Beagle犬4-6kg、雜種犬8-15kg。（年齡與體重一般是呈正比關(guān)系，因此常根據(jù)體重來推算其年齡）同一批試驗動物體重變異范圍不應(yīng)超過該批動物平均體重的20％。

10/6/202323急性毒性作用經(jīng)典的急性毒性試驗2）試驗動物的年齡和體重：10/5/202323急性毒性作用233）試驗動物的性別：一般急性毒性試驗對動物性別要求為雌雄各半。如果在預(yù)試驗時發(fā)現(xiàn)化學(xué)毒物(如農(nóng)藥)對雌、雄動物毒效應(yīng)的敏感性有明顯差異，則應(yīng)單獨分別求出雌性與雄性動物各自的LD50。如果試驗是為致畸試驗作準(zhǔn)備，也可僅作雌性動物的LD50測試。10/6/202324急性毒性作用經(jīng)典的急性毒性試驗3）試驗動物的性別：10/5/202324急性毒性作用經(jīng)典的244）動物數(shù)量與隨機分組：至少3個劑量組，一般5-7劑量組大、小鼠等小動物每組10只狗等大動物每組6只分組原則——隨機化原則5）禁食：經(jīng)消化道染毒（如灌胃）時，要求試驗前對動物禁食大鼠、小鼠——隔夜進(jìn)食；染毒后禁食4h大動物——每日上午喂食前染毒染毒后繼續(xù)禁食2~4h，但在禁食時要保障飲水。6）實驗動物的預(yù)檢：選擇健康動物1~2周的檢疫期，動物在實驗前需飼養(yǎng)觀察3-5d。25急性毒性作用經(jīng)典的急性毒性試驗4）動物數(shù)量與隨機分組：25急性毒性作用經(jīng)典的急性毒性試驗25

2.試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境恒定的溫度：22±3℃濕度：30~70%照度：晝夜各半飼料合格、飲水合格、墊料合格10/6/202326急性毒性作用2.試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境10/5/202326急性毒性作用263.受試物及處理

檢索與受試物化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的化學(xué)物毒性資料一次備齊全部實驗用量應(yīng)以同一批號為宜受試物成分和配方穩(wěn)定不變急性毒性試驗受試物配制的常用劑型：

水溶液、混懸液、油溶液。水溶性受試物的溶劑通常用蒸餾水或去離子水注射等胃腸道外染毒需用生理鹽水，保持與體內(nèi)滲透壓一致水不溶性受試物應(yīng)溶于或懸浮于有機溶劑中，常用0.5%羥甲基纖維素鈉，10%阿拉伯乳膠，天然植物油受試物一般應(yīng)臨用新鮮配制3.受試物及處理274.染毒途徑的選擇:

染毒途徑（exposureroutes）的選擇需考慮：模擬人在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實際接觸受試物的途徑和方式；有利于不同化學(xué)物之間急性毒性大小的比較；受試物的性質(zhì)和用途；各種受試物毒性評價程序的要求等。最常用的染毒途徑為經(jīng)口(胃腸道)經(jīng)呼吸道經(jīng)皮注射途徑

10/6/202328急性毒性作用4.染毒途徑的選擇:10/5/202328急性毒性作用28經(jīng)口(胃腸道)接觸:（oralexposure）

灌胃法、喂飼法、吞咽膠囊

灌胃:（準(zhǔn)確控制劑量，最常用，等容量灌胃法）

小鼠0.2

1.0ml/只或0.1

0.2（0.4）ml/10g大鼠不超過5ml/只或1.0(2.0)ml/100g體重家兔不超過10ml/2kg狗不超過50ml/10kg

10/6/202329急性毒性作用染毒途徑的選擇:經(jīng)口(胃腸道)接觸:（oralexposure）10/529經(jīng)呼吸道接觸

（inhalation）:

研究生產(chǎn)條件下以氣體、蒸氣、粉塵、煙、霧等形式存在的化學(xué)毒物和評價環(huán)境空氣污染物以及吸入給藥途徑的藥物。靜式吸入動式吸入氣管注入法染毒途徑的選擇:經(jīng)呼吸道接觸（inhalation）:染毒途徑的選擇:30靜式吸入：將一定量的易揮發(fā)的靜態(tài)化學(xué)毒物或一定體積的氣態(tài)化學(xué)毒物加入到具有一定體積的密閉容器內(nèi)，使實驗動物吸入染毒。

優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作方便、受試物消耗量少，尤其適合于小鼠接觸易揮發(fā)的液態(tài)或氣態(tài)化學(xué)物的急性毒性試驗。

缺點：隨時間延長氧含量下降、CO2增加；毒物濃度不易長期保持穩(wěn)定，實驗動物有經(jīng)皮吸收的可能。故一般僅用于急性實驗。經(jīng)呼吸道接觸靜式吸入：將一定量的易揮發(fā)的靜態(tài)化學(xué)毒物或一定體積的氣態(tài)化學(xué)31動式吸入：

染毒柜裝備有補充新鮮空氣和排出含化學(xué)毒物之空氣的動力系統(tǒng)以及隨時補充化學(xué)毒物的配氣系統(tǒng)。

優(yōu)點：染毒過程中受試物濃度和氧分壓較穩(wěn)定。

缺點：設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，耗費毒物量較多。經(jīng)呼吸道接觸動式吸入：經(jīng)呼吸道接觸32經(jīng)呼吸道接觸氣管注入法：

經(jīng)喉插入法、氣管穿刺法。

優(yōu)點：1、染毒劑量較準(zhǔn)確，用毒物量少；2、形成中毒模型速度快。缺點：1、操作易造成損傷，引起動物死亡；2、不能發(fā)揮上呼吸道的防衛(wèi)作用，與自然吸入有差異。經(jīng)呼吸道接觸氣管注入法：33染毒途徑的選擇:經(jīng)皮膚染毒（dermalexposure）：

液態(tài)、固態(tài)的化學(xué)毒物。首選大鼠，也可選用家兔和豚鼠。試驗開始前24h，采用動物脊柱兩側(cè)皮膚脫毛（剪毛法、剃毛法、化學(xué)脫毛法）。

局部涂敷受試化學(xué)毒物并以塑料薄膜或玻璃紙和兩層紗布覆蓋，再用無刺激性膠布或繃帶加以固定。24h后取下固定物和覆蓋物，用溫水或適當(dāng)?shù)娜軇┫慈テつw上殘留的受試樣品。

經(jīng)注射途徑染毒（ingestion）：腹腔注射、靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射。染毒途徑的選擇:經(jīng)皮膚染毒（dermalexposure）345.染毒劑量與分組:了解化學(xué)毒物的理化特性，純度，雜質(zhì)成分與含量等。

有相關(guān)毒性資料可供參考者

沒有毒性資料可供查閱者

限量試驗

預(yù)試驗

找出大致致死范圍

(即死亡率從0-10%至90-100%)設(shè)計正式試驗的劑量和分組

近似化學(xué)物的LD50值作預(yù)期毒性的中間劑量，上下各設(shè)計1-2個劑量組進(jìn)行預(yù)實驗LD10、LD90LD0、LD1005.染毒劑量與分組:了解化學(xué)毒物的理化特性，純度，雜質(zhì)成分與35

1．查閱文獻(xiàn)①了解化學(xué)毒物的結(jié)構(gòu)式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)、熔點、沸點、密度、閃點、揮發(fā)度、蒸氣壓、水溶性和脂溶性等理化特性，生產(chǎn)批號及純度，雜質(zhì)成分與含量等。②確定使用哪一種計算方法求LD50，然后再設(shè)計劑量分組。LD50的計算方法常用寇氏法、概率單位法、霍恩法等。③找出與受試化學(xué)毒物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學(xué)物的毒性資料，并以文獻(xiàn)資料中相同的動物種系和相同接觸途徑所測得的LD50(LC50)值作為受試化學(xué)物的預(yù)期毒性中值。10/6/202336急性毒性作用染毒劑量與分組:1．查閱文獻(xiàn)10/5/202336急性毒性作用染毒劑362．預(yù)試驗

①設(shè)定以此預(yù)期值作為待測化學(xué)物的中間劑量組，并在該劑量的上下各設(shè)計l一2個劑量組作為預(yù)試驗劑量。②根據(jù)確定的劑量組進(jìn)行染毒。

如采用10，100，1000mg/kg的劑量↓↓

↓

LD50可能在100-1000mg/kg

不見死亡

全部死亡

③根據(jù)預(yù)試驗的死亡資料確定組距。可根據(jù)以下公式計算出劑量分組：i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或：i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)

i為組距(相鄰的兩個劑量組對數(shù)劑量之差)；n為設(shè)計的劑量組數(shù)。10/6/202337急性毒性作用2．預(yù)試驗10/5/202337急性毒性作用373．正式試驗

一般根據(jù)試驗設(shè)計所選用的LD50計算方法來確定組數(shù)。例如幾率單位法、寇氏法一般設(shè)6～10個劑量組；霍恩法固定設(shè)4個劑量組。求得i值后．以最低劑量組(LD0或LD10)的對數(shù)劑量加上一個i值，即是第二個劑量組的對數(shù)劑量，依此類推直至最高劑量組，查各自的反對數(shù)即得出各組劑量的真實值。

123456LgLD0i+

LgLD0

2i+LgLD03i+LgLD0

4i+LgLD0

???

10/6/202338急性毒性作用在實際工作中，除有特殊規(guī)定外，均不設(shè)立對照組。10/5/202338急性毒性作用在實際工作中，除有特殊規(guī)定386.試驗周期與毒效應(yīng)觀察毒效應(yīng)（毒作用）觀察：1）.中毒癥狀和發(fā)生過程

觀察動物出現(xiàn)的中毒癥狀、發(fā)生的時間、癥狀發(fā)展的經(jīng)過、死亡前的特征以及死亡時間等。2）.體重3）.病理檢查及其他指標(biāo):4）.死亡情況和時間分布毒作用觀察時間和周期：通常14天在實際工作中，對速殺型化學(xué)毒物可以僅計算24h內(nèi)的死亡率，求其LD5010/6/202339急性毒性作用6.試驗周期與毒效應(yīng)觀察10/5/202339急性毒性作用39嚙齒類動物急性毒性試驗主要的觀察項目1）.中毒癥狀嚙齒類動物急性毒性試驗主要的觀察項目1）.中毒癥狀40

2）體重體重可以反映動物中毒后的整體變化。

體重改變的原因很多，若化學(xué)毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗動物飲食減少甚至拒食，表現(xiàn)為體重減輕。若化學(xué)毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也會減輕?；瘜W(xué)毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可能在體重上反映出來。所以，對存活動物尤其是對低于LD50劑量組的存活動物．應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱量其體重的變化．以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時間。10/6/202341急性毒性作用試驗周期與毒效應(yīng)觀察:2）體重10/5/202341急性毒性作用試驗周期與毒效應(yīng)413）.病理檢查及其他指標(biāo):對死亡的動物，均應(yīng)及時進(jìn)行大體解剖和病理組織學(xué)檢查。肉眼觀察主要臟器的大體病理變化，如臟器大小、外觀、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其它改變，對有改變的臟器進(jìn)行取材做組織病理學(xué)檢查對存活動物，在觀察期結(jié)束時進(jìn)行大體病理檢查．必要時做組織病理學(xué)檢查。根據(jù)試驗需要可進(jìn)一步擴大觀察項目．如體溫、心電圖、腦電圖或進(jìn)行某些生化指標(biāo)測定等。10/6/202342急性毒性作用試驗周期與毒效應(yīng)觀察:10/5/202342急性毒性作用試驗周期與毒效應(yīng)觀察:424）.死亡和死亡時間重點觀察和記錄每只動物死亡的時間，特別是最早出現(xiàn)死亡的時間以及各個劑量組動物的死亡數(shù)。分析中毒死亡時間的規(guī)律也可為深人研究化學(xué)物的毒作用機制提供參考。10/6/202343急性毒性作用試驗周期與毒效應(yīng)觀察:10/5/202343急性毒性作用試驗周期與毒效應(yīng)觀察:437.經(jīng)典急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大2.獲得的信息有限3.測得的LD50僅僅是一個近似值4.在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其它化驗檢查所提供的深入細(xì)致的毒性信息。10/6/202344急性毒性作用重要7.經(jīng)典急性毒性試驗的局限性10/5/202344急性毒性作44各種急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)是以LD50/LC50值為基礎(chǔ)劃分的，以往沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。如1994年頒布實施的《食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》中提出急性毒性分級的六級標(biāo)準(zhǔn)(表6-2)。2003年聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦了一個五級標(biāo)準(zhǔn)。各種急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)是以LD50/LC50值為基礎(chǔ)劃分的，以4510/6/202346急性毒性作用GB15193.3食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法急性毒性評價10/5/202346急性毒性作用GB15193.3食品安全4610/6/202347急性毒性評價10/5/202347急性毒性評價47WHO于2003年公布《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》（GHS），2005年修訂，2008年全面實施。急性毒性評價WHO于2003年公布《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》（GH48急性毒性試驗報告受試樣品名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度。試驗動物的種屬、品系和來源。所用劑量和動物分組、每組所用動物性別、數(shù)量級體重范圍。染毒后動物中毒表現(xiàn)和死亡情況及出現(xiàn)時間，大體解剖及病理所見。計算LD50值的方法及其LD50和95%可信限。結(jié)論。急性毒性試驗報告受試樣品名稱、理化性狀、配制方法、所用濃度。49“3R原則”：替代、減少、優(yōu)化

OCED（經(jīng)濟合作和發(fā)展組織）推薦（2001年）：固定劑量法急性毒性分級法上下移動法

USEPA（美國環(huán)境保護(hù)局）三種+限量試驗（并不算真正的替代法，受試物毒性很低時使用）“3R原則”：替代、減少、優(yōu)化501.固定劑量法（fixeddoseprocedure）：不以動物死亡作為觀察終點，而是利用預(yù)先選定的或固定的一系列劑量染毒，從而觀察化學(xué)物的毒性反應(yīng)來對化學(xué)物的毒性進(jìn)行分級。劑量范圍5、50、300mg/kg，最高位2000mg/kg。EEC歐共體分級標(biāo)準(zhǔn)為：高毒（LD50<25mg/kg），有毒（25-200mg/kg），有害（200-2000mg/kg），不分級（>2000mg/kg）觀察終點：

明顯毒性（clearsignontoxicity）：明確的毒作用表現(xiàn)，可作為危險度評價的充分依據(jù)，預(yù)期隨著染毒劑量的增加可發(fā)展為嚴(yán)重的中毒癥狀直至死亡。固定法的實驗結(jié)果與經(jīng)典方法相比，一致性為80.2%，使用動物少，大鼠平均14.8只。51急性毒性替代試驗1.固定劑量法（fixeddoseprocedure）：51★預(yù)試驗：選擇5、50、300和2000mg/kg4個固定劑量，特殊情況下可增加1個5000mg/kg劑量。采用單性別（一般為雌性）1只動物循序進(jìn)行，根據(jù)受試物的有關(guān)資料，從上述劑量中選擇1個作為初始劑量；如沒有相關(guān)資料可參考，可用300mg/kg作為初始劑量進(jìn)行預(yù)試驗。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果選擇一個能產(chǎn)生明顯毒性效應(yīng)但不引起死亡的劑量進(jìn)行正式試驗?！镱A(yù)試驗：52注：A——死亡；B——明顯毒性；C——無毒性注：A——死亡；B——明顯毒性；C——無毒性53WHO于2003年公布《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》（GHS），2005年修訂，2008年全面實施。急性毒性評價WHO于2003年公布《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》（GH54注：A——死亡；B——明顯毒性；C——無毒性注：A——死亡；B——明顯毒性；C——無毒性55★正式試驗每個劑量組5只動物（包括預(yù)試驗在該水平做過的動物）。一般只需一個劑量。如果正式試驗選擇的起始劑量未見明顯毒性，應(yīng)接著進(jìn)行下一個較高劑量的染毒。如正式試驗選擇的起始劑量出現(xiàn)動物死亡或嚴(yán)重毒性反應(yīng)時，應(yīng)從保護(hù)動物免受痛苦出發(fā)，選擇下一個較低劑量進(jìn)行。出現(xiàn)下列情況結(jié)束試驗：當(dāng)出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)或已確認(rèn)不多于一只動物死亡；最高劑量未出現(xiàn)毒性反應(yīng)；最低劑量動物出現(xiàn)死亡。應(yīng)在確認(rèn)前一個劑量組的動物存活后，才可進(jìn)行下一個劑量試驗。一般兩個劑量組試驗之間要間隔3～4d?！镎皆囼?6★限量試驗：如果有相關(guān)的資料表明受試物可能無毒，可進(jìn)行限量試驗。染毒劑量為2000mg/kg（5000mg/kg），選擇另外4只動物進(jìn)行。預(yù)試驗和正式試驗都不出現(xiàn)中毒體征，試驗終止?！锝Y(jié)果判定：GHS類別。★限量試驗：57注：A——死亡數(shù)大于或等于2只（計量>=LD50）；B——觀察到明顯毒性，大于或等于1只，或者1只死亡（計量<LD50）；C——無毒性。正式試驗觀測終點：明顯毒性（>=1只動物死亡）注：A——死亡數(shù)大于或等于2只（計量>=LD50）；B——觀58WHO于2003年公布《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》（GHS），2005年修訂，2008年全面實施。急性毒性評價WHO于2003年公布《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》（GH592.急性毒性分級法（acutetoxicclassmethod）：是基于生物統(tǒng)計法，以死亡為終點的分階段試驗法，每階段3只單性別動物，根據(jù)死亡動物數(shù)，判定大致的LD50值范圍，平均2-4階段即可判定急性毒性。單性別3只動物（通常為雌性，如雄性更敏感則用雄性）。從5、50、300、2000mg/kg4個固定劑量中選擇一個劑量開始進(jìn)行試驗。根據(jù)死亡動物數(shù)，決定下一階段：★不需要進(jìn)一步試驗即可分級；★下一階段以相同劑量的另一種性別試驗；★下一階段以較高或較低的劑量水平進(jìn)行（從300mg/kg開始）。10/6/2023602.急性毒性分級法（acutetoxicclassme603.上-下移動法（階梯法,up/downprocedure）以死亡為終點，但也可觀察不同的終點。推薦的劑量序列：1.75，5.5，17.5，55，175，550，2000mg/kg。如無毒性資料可參考，推薦從175mg/kg開始。如有資料參考，從比理論LD50值稍低的劑量開始。一只動物序貫進(jìn)行，需單性別毒物6～10只。染毒后觀察48h。存活：下一只動物提高一檔劑量；死亡：下一只動物降低一檔劑量；每一只存活的動物都要觀察至14天。后期死亡動物在統(tǒng)計結(jié)果時也記為死亡。上下法和經(jīng)典法一致性為23/25，上下法與固定劑量法一致性為16/20,其動物數(shù)量用的較少。613.上-下移動法（階梯法,up/downprocedure61LD50意義LD50是統(tǒng)計學(xué)方法計算得值，重現(xiàn)性好，相對穩(wěn)定LD50反映受試動物群體中大多數(shù)動物感受的平均情況，具有代表性，從劑量-死亡曲線看，LD50處于曲線上升中段，是死亡率相對劑量變化最敏感的部位。LD50標(biāo)準(zhǔn)化藥物毒作用強度，可比較不同藥物的毒性大小。計算藥物的治療指數(shù)，藥效劑量和毒性劑量的距離。為后續(xù)重復(fù)給藥毒理學(xué)實驗劑量的選擇提供參考通過比較不同途徑LD50，可獲得生物利用度的信息推測人類的致死劑量和中毒體征，為臨床毒副反應(yīng)提供監(jiān)測參考。62LD50意義6262LD50局限性LD50是以死亡為觀察終點，無法反映化學(xué)物的作用部位和作用機制。評價新藥或化學(xué)物時，LD50給予有效的信息較少，實用性有限。LD50波動性很大，影響因素很多，如:動物種屬、品系、遺傳易感性、性別、年齡、身體狀況、染毒途徑、實際環(huán)境條件及操作者熟練程度僅僅反映急性致死性程度，局限性較大。單次大劑量中毒試驗，動物多死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管功能障礙，不能很好地顯示毒性。人和動物敏感性有差異。消耗的動物量大，一次試驗至少需要30-50只動物。10/6/202363LD50局限性10/5/20236363

局部毒性是指化學(xué)毒物與機體直接接觸部位處的損傷作用。用于評價機體接觸化學(xué)毒物的局部（如皮膚、眼睛等）所出現(xiàn)的損傷作用。局部毒性反應(yīng)往往發(fā)生在全身毒性作用之前，因此研究局部毒性作用有助于早期脫離接觸，避免全身毒性作用。

通常包括：皮膚刺激試驗、皮膚致敏試驗（皮膚變態(tài)反應(yīng)）和眼刺激試驗等。目的：眼刺激、皮膚刺激試驗：了解化學(xué)物對皮膚和眼睛的局部刺激性和腐蝕性。皮膚致敏試驗：了解化學(xué)物對哺乳動物是否可以引起皮膚變態(tài)反應(yīng)極其程度。第三節(jié)局部毒性作用局部毒性是指化學(xué)毒物與機體直接接觸部位處的損傷作用。64一、急性眼刺激試驗

(acuteeyeirritationtest)

目的：確定和評價化學(xué)毒物對眼睛是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度。觀察終點為眼刺激和眼腐蝕

眼刺激性：指眼睛表面接觸受試物后眼睛產(chǎn)生的可逆性炎癥變化。

眼腐蝕性：指眼睛表明接觸受試物后眼睛產(chǎn)生的不可逆性組織損傷。一、急性眼刺激試驗

(acuteeyeir65強酸或強堿性物質(zhì)免做眼刺激試驗。目前常用的方法為Draize法，根據(jù)家兔眼結(jié)膜、角膜和虹膜反應(yīng)進(jìn)行評分。4只家兔，眼瞼內(nèi)滴入受試物，閉合眼瞼約1min，觀察，評價分級。觀察內(nèi)容：結(jié)膜（發(fā)紅、球結(jié)膜水腫、分泌物）角膜（渾濁程度和范圍）虹膜（充血、腫脹、角膜周圍充血）觀察周期：一般7天，必要可延長到21天。急性眼刺激試驗強酸或強堿性物質(zhì)免做眼刺激試驗。急性眼刺激試驗66二、皮膚刺激試驗皮膚刺激：局部可逆性的炎性變化。皮膚腐蝕：不可逆性組織損傷。有3種情況不做皮膚刺激試驗：（1）腐蝕性物質(zhì)，（2）急性經(jīng)皮毒性試驗顯示有很強系統(tǒng)毒性的物質(zhì)；（3）急性經(jīng)皮毒性試驗染毒劑量達(dá)2000mg/kg仍未產(chǎn)生皮膚刺激體征物質(zhì)。皮膚刺激評價方法采用Draize試驗。家兔或豚鼠4只，剪去背毛，涂受試物，蓋防護(hù)裝置，4h后洗去觀察。觀察內(nèi)容：皮膚反應(yīng)（紅斑、水腫、紫色紅斑、結(jié)痂）觀察周期：一般不超過14天。皮膚刺激分級：無刺激性、輕刺激性、中等刺激性、強刺激性10/6/202367二、皮膚刺激試驗10/5/20236767三、皮膚致敏試驗是一種對化學(xué)物質(zhì)免疫介導(dǎo)的皮膚反應(yīng)，特點為瘙癢、紅斑、水腫、丘疹、小水泡、大皰或兼而有之。目的：通過動物實驗預(yù)測化學(xué)品經(jīng)皮膚接觸對人類引起皮膚致敏反應(yīng)的危害。皮膚致敏試驗：一是福氏完全佐劑的方法，二是不加佐劑的方法。通常選擇豚鼠作為實驗對象，先誘導(dǎo)接觸，再激發(fā)接觸。觀察內(nèi)容：紅斑、水腫、結(jié)痂觀察期限：激發(fā)后觀察24h，48h，72h，直至12天。0天28天14天40天7天誘導(dǎo)誘導(dǎo)誘導(dǎo)激發(fā)觀察結(jié)束三、皮膚致敏試驗0天28天14天40天7天誘導(dǎo)誘導(dǎo)誘導(dǎo)激發(fā)觀68蓄積毒性試驗亞慢性毒性試驗慢性毒性試驗10/6/202369第四節(jié)短期、亞慢性、慢性毒性作用蓄積毒性試驗10/5/202369第四節(jié)短期、亞慢性、慢性69一、基本概念二、

蓄積毒性試驗方法及其評價10/6/202370蓄積作用及其評價一、基本概念10/5/202370蓄積作用及其評價70

蓄積作用(accumulation)：指外源化學(xué)物連續(xù)地、反復(fù)地進(jìn)入機體，而且吸收速度（或總量）超過代謝轉(zhuǎn)化排出的速度（或總量）時，化學(xué)物質(zhì)就有可能在體內(nèi)逐漸增加并貯留，稱為化學(xué)物質(zhì)的蓄積作用。蓄積作用是發(fā)生慢性毒作用的前提。儲存庫depot：化學(xué)毒物容積蓄積的組織或器官。機體常見的儲存庫：血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼等。

10/6/202371蓄積作用及其評價10/5/202371蓄積作用及其評價71

蓄積作用實際上有二個含義：

物質(zhì)蓄積(materialaccumulation)實驗動物反復(fù)接觸化學(xué)物后可以用分析方法在體內(nèi)測出物質(zhì)的原型或代謝產(chǎn)物。

功能蓄積(functionalaccumulation)也叫損傷蓄積（Damageaccumulation）長期接觸后，體內(nèi)雖不能測出其原型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。10/6/202372蓄積作用及其評價蓄積作用實際上有二個含義：10/5/202372蓄72蓄積作用的毒理學(xué)意義：發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)評價該毒物能否引起慢性中毒的依據(jù)之一制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時選擇安全系數(shù)的主要依據(jù)10/6/202373蓄積作用的毒理學(xué)意義：10/5/20237373二、蓄積毒性試驗方法

1蓄積系數(shù)法

2生物半減期法

蓄積毒性試驗?zāi)康模菏峭ㄟ^試驗求出蓄積系數(shù)K，了解化學(xué)毒物蓄積毒性的強弱，并為慢性毒性試驗及其他有關(guān)毒性試驗的劑量選擇提供參考。二、蓄積毒性試驗方法

1蓄積系數(shù)法

2生物半減期法

74(一)蓄積系數(shù)法蓄積系數(shù)K(accumulationcoefficient)是指多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應(yīng)（或死亡）的蓄積劑量[ED50(n)]與一次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)相同效應(yīng)（或死亡）的劑量[ED50(l)]的比值。即：K＝ED50(n)/ED50(1)（以出現(xiàn)生物效應(yīng)或特異性損傷為指標(biāo)）K＝LD50(n)/LD50(1)（以死亡為指標(biāo)）

n―多次接觸受試物時產(chǎn)生預(yù)期效應(yīng)的蓄積劑量的總和1―一次接觸該物質(zhì)產(chǎn)生相同效應(yīng)的一次劑量10/6/202375蓄積作用及其評價(一)蓄積系數(shù)法10/5/202375蓄積作用及其評價75蓄積系數(shù)K蓄積毒性分級K＜1高度蓄積1≤K＜3明顯蓄積3≤K＜5中等蓄積K≥5輕度蓄積蓄積系數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)：

K=ED50(n)/ED50(1)或K=LD50(n)/LD50(1)

蓄積系數(shù)K蓄積毒性分級K＜1高度蓄積1≤K＜3明顯蓄積3≤K76蓄積系數(shù)法常用的實驗方案：固定劑量法劑量遞增法劑量固定的20天蓄積法蓄積系數(shù)法常用的實驗方案：固定劑量法771．固定劑量法：一般常選用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法進(jìn)行染毒。先求出LD50，然后選取相同條件的40只(或更多)實驗動物，分為兩組，一為染毒組，一為對照組，每組至少20只，雌雄各半。試驗組在1／20～l／50LD50的范圍內(nèi)選定一個劑量，每日以固定劑量、定時和相同途徑進(jìn)行染毒,試驗期間觀察記錄每組動物死亡數(shù)。當(dāng)試驗組累積發(fā)生一半動物死亡即可終止試驗。此時，計算累積總接觸劑量[LD50(n)]，根據(jù)公式計算K值，然后依表蓄積系數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價。但若接觸劑量已累積達(dá)到5個LD50劑量（K>5），也可終止試驗。10/6/202378蓄積作用及其評價1．固定劑量法：10/5/202378蓄積作用及其評價782．劑量遞增法：

10/6/202379

在試驗期間，當(dāng)化學(xué)毒物引起動物累積死亡一半時即可終止試驗，計算K值進(jìn)行評價。一般來說，在試驗第2l天也可結(jié)束試驗，因為這之前如果動物沒有死亡或死亡數(shù)不足一半，說明其累積劑量已達(dá)5.26LD50，即K＞5。使用本方法時要注意染毒期間定期(每4天一次)給動物稱重，按實測體重，調(diào)整化學(xué)毒物的染毒絕對量。蓄積作用及其評價2．劑量遞增法：10/5/202379在試驗期間，當(dāng)793．劑量固定的20天蓄積法：

它通常采用經(jīng)口灌胃染毒方式，將動物隨機分為5個組，包括陰性對照組和1/20LD50、l/10LD50、1/5LD50和1/2LD50四個劑量組，每組動物數(shù)10只，雌雄各半。每日染毒一次，連續(xù)染毒20天。觀察每組雌雄合計的死亡動物數(shù)量。試驗結(jié)束時根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定：①各劑量組均無死亡，即為蓄積性不明顯；②如僅1/2LD50劑量組有死亡，其他組均無死亡，則為弱蓄積性；③如1/20LD50劑量組無死亡，其他各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系時，則為中等蓄積性；④如1/20LD50劑量組有死亡，且有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為強蓄積性。

10/6/202380蓄積作用及其評價3．劑量固定的20天蓄積法：10/5/202380蓄積作用及806-第六章--外源化學(xué)物的一般毒性作用解讀課件81(二)生物半減期法：生物半減期(biologicalhalf-life，t1/2)法是用毒物動力學(xué)原理描述化學(xué)毒物在機體內(nèi)的蓄積作用。t1/2的測定測定整個機體的半減期較為復(fù)雜，通常是間接測定環(huán)境污染物在血液中的濃度降低50％所需的時間。10/6/202382蓄積作用及其評價(二)生物半減期法：10/5/202382蓄積作用及其評價82化學(xué)毒物在體內(nèi)蓄積的速度和量：與機體單位時間內(nèi)吸收該物質(zhì)的速度以及清除速度有關(guān)。即使化學(xué)毒物以相等的時間間距恒速地吸收入血液，該物質(zhì)在一定劑量范圍內(nèi)在機體的蓄積量也不呈直線無限地增加，而是呈曲線形上升并有一定的極限。這是因為化學(xué)物質(zhì)吸收進(jìn)入機體的同時體內(nèi)也發(fā)生著代謝轉(zhuǎn)化及清除的過程(包括血中化學(xué)毒物向組織臟器的分配過程)。當(dāng)化學(xué)毒物的吸收過程與代謝轉(zhuǎn)化—清除的過程達(dá)到平衡時，其蓄積量基本上不再增加。蓄積極限值=每日吸收量*生物半減期*常數(shù)一般來說，t1/2d較短的化學(xué)毒物達(dá)到蓄積極限所需的時間也短，t1/2長者達(dá)到蓄積極限的時間也長。但是一旦機體停止接觸該化合物，也易于很快從機體內(nèi)清除完畢化學(xué)毒物在體內(nèi)蓄積的速度和量：與機體單位時間內(nèi)吸收該物質(zhì)的速83化學(xué)物質(zhì)在機體內(nèi)的理論蓄積曲線第2個t1/2:達(dá)最大蓄積量75%第3個t1/2

:達(dá)最大蓄積量87.5%第6個t1/2:達(dá)最大蓄積量理論蓄積曲線：化學(xué)物質(zhì)在機體內(nèi)的理論蓄積曲線第2個t1/2:達(dá)最大蓄積量84一

亞慢性毒性作用：

亞慢性毒性的概念

亞慢性毒性試驗的目的

亞慢性毒性試驗的設(shè)計

二慢性毒性作用：

慢性毒性的概念

慢性毒性試驗的目的

慢性毒性試驗設(shè)計

10/6/202385亞慢性和慢性毒性試驗一亞慢性毒性作用：10/5/202385亞慢性和慢性毒性85(一)概念：

亞慢性毒性(subchronictoxicity)是指人或?qū)嶒瀯游镞B續(xù)接觸較長時間、較大劑量的外源化合物所引起的毒性效應(yīng)。（1-6個月）慢性毒性(chronictoxicity)是指人或?qū)嶒瀯游镩L期(甚至終生)反復(fù)接觸低劑量的化學(xué)毒物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。（一般指2年）10/6/202386亞慢性和慢性毒性試驗(一)概念：10/5/202386亞慢性和慢性毒性試驗866-第六章--外源化學(xué)物的一般毒性作用解讀課件87（二）試驗?zāi)康模?/p>

1.確定受試物亞慢性和慢性毒性的效應(yīng)譜，對在急性及亞急性毒性試驗中發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，并發(fā)現(xiàn)在急性及亞急性毒性試驗中未發(fā)現(xiàn)的毒作用；2.研究受試物亞慢性和慢性毒作用的靶器官；3.研究受試物亞慢性和慢性毒性劑量—反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量（NOAEL），提出此受試物的安全限量參考值;4.研究受試物亞慢性和慢性毒性損害的可逆性;5.亞慢性毒性試驗為慢性毒性試驗的劑量設(shè)計及觀察指標(biāo)選擇提供依據(jù);6.確定不同動物物種對受試物亞慢性和慢性毒效應(yīng)的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。10/6/202388亞慢性和慢性毒性試驗（二）試驗?zāi)康模?0/5/202388亞慢性和慢性毒性試驗88

（一）實驗動物選擇1，物種和品系一般要求選擇兩個動物種屬：大鼠：Wistar，SD。犬：Beagle犬2，性別、年齡、動物數(shù)一般雌雄各半，特殊如研究性腺毒性可選單一性別。10/6/202389亞慢性和慢性毒性試驗（一）實驗動物選擇10/5/202389亞慢性和慢性89微生物學(xué)寄生蟲等級和飼養(yǎng)環(huán)境：

清潔級以上等級大小鼠

屏蔽環(huán)境內(nèi)進(jìn)行實驗

亞慢性毒性試驗?zāi)挲g：大鼠6-8周（80~100g）