PCR技術(shù)及其應(yīng)用-1

PCR技術(shù)及其應(yīng)用PCR技術(shù)原理5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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一、基本工作原理目錄Cycle35

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C實驗儀器電泳儀瓊脂糖凝膠電泳槽電泳技術(shù)（２）鑒定DNA分子量(3)膠回收純化DNAlow-meltagarosePCR儀PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點實驗結(jié)果PCR結(jié)果。1、對照(無模板)；2－6、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）凝膠成像系統(tǒng)PCR的類型㈠巢式PCR㈦原位PCR㈡多重PCR㈧定量PCR㈢不對稱PCR㈨差異顯示PCR㈣共享引物PCR㈩重組PCR㈤錨定PCR(十一)RT-PCR㈥彩色PCR

(十二)RAPD----------

多重PCR:是指在一個單一反應(yīng)中同時擴增多個序列的反應(yīng)過程，能夠節(jié)省時間和精力。定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標準,通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測,進行PCR起始模板量的定量。用于擴增已知一端序列的目的DNA

錨定PCR：使用一條錨定引物就一條特異性引物擴增已知一端序列的目的DNA。

基本概念增效PCR（boosterPCR）當擴增少于1000拷貝的模板DNA時會遇到兩個問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴增，消耗了引物和酶，而特異擴增片段產(chǎn)量降低。對于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進行初級PCR，此時由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15～20個循環(huán)后補充產(chǎn)物量，以初級PCR產(chǎn)物為模板進行擴增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。在同一PCR體系中加入數(shù)對PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時擴增多個DNA片段。多重PCR常用來檢測同一基因的多個外顯子的缺失，或在檢測缺失設(shè)置內(nèi)對照。多重PCR

巢式PCR：利用兩套PCR引物對進行兩輪PCR擴增反應(yīng)組成，在第一輪擴增中，外引物用以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進行第二輪擴增。差別顯示ＰＣＲ：是根據(jù)絕大多數(shù)真核細胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。不對稱PCR目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究

高濃度引物低濃度引物PCR技術(shù)應(yīng)用研究基因克隆，DNA測序，分析突變(

制備雜交探針)遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達圖譜診斷遺傳疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學中個體識別、親子鑒定,

犯罪現(xiàn)場標本分析大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因基因工程產(chǎn)品×MstⅡ酶切位點(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析RLFP分析法PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。

PCR-SSCP過程：

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入PCR擴增產(chǎn)物

↓

變性↓

單鏈DNA↓中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者3.為雜合子

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解鏈構(gòu)像DAN原理過程DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子8～19缺失B：病人A中未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式多重PCR檢測DMD基因缺失不對稱PCR目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究

高濃度引物低濃度引物反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon常規(guī)PCR方法的局限性分析：無法對起始模板準確定量,只能對終產(chǎn)物進行分析必須在擴增后用電泳方法分