b第三章 目的基因?qū)爰?xì)胞

基因工程第三章目的基因?qū)爰?xì)胞3.1目的基因基因工程的主要目的是通過優(yōu)良性狀相關(guān)基因的重組，獲得具有高度應(yīng)用價(jià)值的新物種。為此必須從現(xiàn)有生物群體中，根據(jù)需要分離出可用于克隆的此類基因。這樣的基因通常稱這目的基因。目的基因主要是結(jié)構(gòu)基因。3.1.1結(jié)構(gòu)基因組成作為一個(gè)能轉(zhuǎn)錄和翻譯的結(jié)構(gòu)基因必須包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。啟動(dòng)子是DNA上RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和促使轉(zhuǎn)錄的一段核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄mRNA的第一個(gè)堿基被定為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，這個(gè)堿基多數(shù)情況下是A，以此作為序列的+1，其上游的核苷酸序列為“-”，下游的核苷酸序列為“+”?；蚓幋a區(qū)包括起譯碼ATG、開讀框和休止碼TAA（或TAG、TGA）。終止子是一個(gè)提供轉(zhuǎn)錄停止信息的核苷酸序列。不同類型基因組的基因組成稍有不同，因此必須根據(jù)基因組類型和實(shí)驗(yàn)需要來分離含目的基因的DNA片段。3.1.1.1原核生物結(jié)構(gòu)基因的組成原核生物的基因多數(shù)以操縱子形成存在。完成同類功能的多個(gè)基因聚集在一起，處于同一個(gè)啟動(dòng)子的調(diào)控之下，下游同具一個(gè)終止子，但各基因分別有起譯碼ATG和休止碼TAA（或TAG、TGA）。操縱子除啟動(dòng)子外，往往還有一些調(diào)控轉(zhuǎn)錄的其他因子，如乳糖操縱子除啟動(dòng)子（p）外，還有調(diào)節(jié)因子（i）和操縱因子（o）。原核生物基因在起譯碼ATG上游約10bp處，有一個(gè)富含嘌呤核苷酸的SD保守序列區(qū)，一般為AGGA，由此區(qū)轉(zhuǎn)錄的序列是翻譯時(shí)核糖體識(shí)別、結(jié)合mRNA的位置。核糖體由此位置向前移動(dòng)，尋找起譯碼AUG。

原核生物基因轉(zhuǎn)錄終止之前有一段回文序列結(jié)構(gòu)，稱為終止子，使RNA聚合酶減緩移動(dòng)或停止RNA的合成。但不是所有回文序列結(jié)構(gòu)都是終止子。3.1.1.2真核生物結(jié)構(gòu)基因的組成真核生物染色體基因組的基因是單獨(dú)存在的，并且兩個(gè)基因之間有很長(zhǎng)的間隔序列區(qū)，甚至起譯碼與休止碼之間除編碼序列區(qū)外還有一至多個(gè)非編碼序列間隔區(qū)，稱為內(nèi)含子，而編碼序列區(qū)稱為外顯子。真核生物結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子通常包含3個(gè)保守序列區(qū)：在-20至-30序列區(qū)有一個(gè)TATA框，DNA雙鏈在此外開始解開；在-75序列區(qū)有一個(gè)CAAT框，其作用是與RNA聚合酶結(jié)合有關(guān)；在更上游處有一個(gè)GC框，是某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的序列。對(duì)真核生物基因轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)和終止過程了解甚少。不過發(fā)現(xiàn)高等真核生物結(jié)構(gòu)基因休止碼序列下游有一保守的AATAAA序列提供轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的釋放信號(hào)。此外，真核生物染色體基因組的結(jié)構(gòu)基因不具SD序列區(qū)，核糖體與轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)合靠mRNA5'端添加的“帽”結(jié)構(gòu)。3.1.2分離目的基因的途徑根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，待分離的目的基因可能是包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)、基因編碼區(qū)和終止區(qū)的全功能基因，甚至是一個(gè)完整的操縱子或由幾個(gè)功能基因、幾個(gè)操縱子聚集在一起的基因簇；也可能是只具基因的編碼序列，甚至是只含啟動(dòng)子或終止子等元件的DNA片段；不同基因組類型的基因大小和基因組成也各不相同。因此分離目的基因應(yīng)采用不同的途徑和方法。3.1.2.1通過構(gòu)建cDNA文庫和基因組文庫分離

目的基因通過轉(zhuǎn)錄和加工，每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的一個(gè)mRNA分子，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄可產(chǎn)生相應(yīng)的cDNA（complementaryDNA，互補(bǔ)DNA）。這樣產(chǎn)生的cDNA只含基因編碼序列，不具啟動(dòng)子和終止子以及內(nèi)含子。3.1.2.1通過構(gòu)建cDNA文庫和基因組文庫分離

目的基因某生物基因組經(jīng)轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與合適的克隆載體連接，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)（轉(zhuǎn)化）貯存在一種受體菌的群體之中。把這種包含某生物基因組全部基因cDNA的受體菌群體稱為該生物cDNA文庫。如果此群體只貯存某生物基因組的部分基因的cDNA，則稱為部分cDNA文庫。隨后通過分子雜交等方法從cDNA文庫中釣出含目的基因的菌株。用此方法獲得的目的基因只有基因編碼區(qū)，進(jìn)行表達(dá)還須外加啟動(dòng)子和終止子等調(diào)控轉(zhuǎn)錄的元件。在生物體中，某種基因轉(zhuǎn)錄的mRNA在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞內(nèi)的豐度往往是不同的。mRNA豐度越高的基因越容易得到。因此為了獲得某種目的基因，必須選用含這種目的基因的mRNA豐度高的組織來構(gòu)建cDNA文庫。包含某種生物基因組全部遺傳信息的一系列DNA片段，通過克隆載體貯存在一種受體菌的群體之中，這個(gè)群體稱為這種生物的基因組文庫。

同樣可以通過分子雜交等方法從基因組文庫中釣出目的基因。構(gòu)建基因組文庫的途徑基本上與cDNA文庫相似，主要區(qū)別是用限制性內(nèi)切酶直接對(duì)基因組DNA進(jìn)行部分酶切，產(chǎn)生一系列大小不等的DNA片段，再與合適的克隆載體連接，轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化受體菌。

這樣構(gòu)建的基因組文庫中，有的受體細(xì)胞克隆了含有轉(zhuǎn)錄整套調(diào)控因子的全功能基因，甚至含有整個(gè)操縱子或基因簇；有的可能只克隆了啟動(dòng)子、或終止子、或基因編碼區(qū)、或它們的一部分，甚至只是間隔序列。為了能克隆含有完整的全功能的基因或操縱子的大片段DNA，一般采用cosmid載體。因?yàn)閏osmid載體可以承載30kb左右的較大外源DNA片段。

如果已知目的基因的分子大小，或已知待克隆的DNA片段大小范圍，則可先通過基因組DNA酶切片段的凝膠電泳，回收大于待克隆的DNA片段，構(gòu)建部分基因組文庫，可以減少從文庫中釣出目的基因的工作量。

為了從cDNA文庫和基因組文庫中釣出目的基因，如果已經(jīng)分離得到目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，那么可以先測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列，再根據(jù)氨基酸序列確定核苷酸序列，人工合成探針，同文庫中的菌落或噬菌斑進(jìn)行原位雜交，有明顯雜交信號(hào)的菌落或噬菌斑就含有目的基因。3.1.2.2用PCR技術(shù)從基因組中擴(kuò)增出目的基因PCR（polymerasechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是以DNA的一條鏈為模板，在多聚酶的催化下，通過堿基配對(duì)使寡核苷酸引物向3‘方向延長(zhǎng)合成模板的互補(bǔ)鏈。PCR包括3個(gè)反應(yīng)過程：雙鏈DNA變性（90~95℃）成為單鏈DNA、引物復(fù)性（37~60℃）同單鏈DNA互補(bǔ)序列結(jié)合、DNA聚合酶催化（70~75℃）使引物延伸。這三個(gè)基本步驟重復(fù)進(jìn)行，可以使特異性DNA的擴(kuò)增率達(dá)到數(shù)百萬倍（≥2×106）。該過程見圖2-10。如此經(jīng)過25~30次循環(huán)，產(chǎn)生大量待擴(kuò)增的特異性DNA片段，足夠用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和分析。圖2-10PCR反應(yīng)過程的原理PCR是目前分離篩選目的基因的一種有效方法。若已知目的基因兩側(cè)的20個(gè)以上的核苷酸序列，則可設(shè)計(jì)和人工合成一對(duì)寡核苷酸引物，擴(kuò)增出含目的基因的DNA片段。3.2目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因能否有效地導(dǎo)入受體細(xì)胞，取決于是否選用合適的受體細(xì)胞、合適的克隆載體和合適的基因轉(zhuǎn)移方法。3.2.1受體細(xì)胞所謂基因克隆的受體細(xì)胞，是能攝取外源DNA（基因）并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞；從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價(jià)值和理論研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞。原核生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞可以作為受體細(xì)胞，但不是所有細(xì)胞都可以作為受體細(xì)胞。原核生物細(xì)胞是一類很好的受體細(xì)胞，容易攝取外界的DNA，增殖快，基因組簡(jiǎn)單，便于培養(yǎng)和基因操作，普遍被用作cDNA文庫和基因組文庫的受體菌，或者用來建立生產(chǎn)目的基因產(chǎn)物的工程菌，或者作為克隆載體的宿主。目前用作基因克隆受體的原核生物主要是大腸桿菌，藍(lán)藻和農(nóng)桿菌等也被廣泛應(yīng)用。真核生物細(xì)胞作為基因克隆受體近來已受到很大的重視，如酵母和某些動(dòng)植物的細(xì)胞。

由于酵母的某些性狀類似原核生物，所以較早就被用作基因克隆受體。

雖然動(dòng)物細(xì)胞也已被用作受體細(xì)胞，但由于體細(xì)胞不易再分化成個(gè)體，所以采用受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞，由此培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

植物細(xì)胞作為基因克隆的受體細(xì)胞，有其優(yōu)于動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)，一個(gè)活的離體體細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下比較容易再分化成植株，意味著一個(gè)獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)成能傳代的植株，成為轉(zhuǎn)基因植物。由于這個(gè)原因，近年來植物基因工程發(fā)展非常迅速。3.2.2目的基因片段組入克隆載體目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，一般須先把含目的基因的DNA片段組入合適的克隆載體。為選用合適的克隆載體，必須注意以下幾點(diǎn)：①為了使組入的目的基因能夠在受體細(xì)胞中有效表達(dá)，應(yīng)選用具強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體，除非目的基因本身已具備在受體細(xì)胞內(nèi)有功能的強(qiáng)啟動(dòng)子。②選用的克隆載體便于同含目的基因的DNA片段進(jìn)行連接。③根據(jù)確定的受體系統(tǒng)，選用相應(yīng)的克隆載體，因?yàn)橛米魇荏w細(xì)胞的不同生物類型有各自適用的克隆載體。隨著基因轉(zhuǎn)移方法的不斷發(fā)展，原來不能用于某種受體細(xì)胞的克隆載體，由于采用電擊儀和基因槍等新的基因轉(zhuǎn)移方法成為可用的載體。有時(shí)當(dāng)克隆載體確定后，為了使含目的基因的DNA片段能組入克隆載體，往往還須對(duì)DNA片段末端進(jìn)行適當(dāng)?shù)募庸ぁ?/p>

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，有了合適的克隆載體和含目的基因的DNA片段，則選用限制性內(nèi)切酶切割，并用DNA連接酶連接，得到預(yù)期的重組DNA分子。3.2.3重組DNA分子導(dǎo)入原核生物細(xì)胞大腸桿菌是用得最廣泛的基因克隆受體，可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和三親本雜交等途徑，把重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。3.2.3.1轉(zhuǎn)化途徑攜帶基因的外源DNA分子通過與膜結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在其中穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化（transformation）。DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的技術(shù)路線包括制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化處理。感受態(tài)細(xì)胞指處于能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞。為制備感受態(tài)細(xì)胞，在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)受體菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，離心收獲菌體，將其懸浮在含CaCl2（50~100mmol/L）的無菌緩沖液中，置冰浴中15min后，離心沉淀，再次懸浮在含CaCl2的緩沖液中，4℃下放置12~14h，便成為可用于轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化過程：

向新制備的感受態(tài)受體細(xì)胞懸浮液中加入重組DNA溶液，使CaCl2終濃度為50mmol/L，置于冰水浴中1h左右，轉(zhuǎn)移至42℃水浴中放置2min，促進(jìn)受體細(xì)胞吸收DNA，馬上轉(zhuǎn)移到37℃水浴中培養(yǎng)5min，加入適量LB培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)30~60min，就可以接種在選擇培養(yǎng)基上篩選克隆子。3.2.3.2轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過噬菌體（病毒）顆粒感染，把DNA導(dǎo)入被感染的受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。含目的基因的DNA與噬菌體（病毒）載體的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，一般先須進(jìn)行體外包裝。為此，根據(jù)λ噬菌體體內(nèi)包裝的原理，獲得了分別缺D蛋白和E蛋白λ噬菌體突變株的兩種溶源菌。這兩種溶源菌單獨(dú)培養(yǎng)，因各缺一種包裝必備的蛋白質(zhì)，所以體內(nèi)即使有λDNA也不能進(jìn)行包裝，因此細(xì)胞內(nèi)積累了大量除一種以外的其他供包裝用的蛋白質(zhì)。如果在試管內(nèi)混合兩種溶源菌合成的蛋白質(zhì)，D蛋白和E蛋白互相補(bǔ)充，就可以包裝λDNA或重組的λDNA。其主要過程舉例如下：（1）制備包裝用蛋白質(zhì)培養(yǎng)溶源菌BHB2690（D蛋白缺失）和BHB2688（E蛋白缺失）至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，誘導(dǎo)溶菌生長(zhǎng)，混合兩種培養(yǎng)物，離心沉淀，懸浮于合適的緩沖液中，快速分裝（每管50μl），置于液氮中速凍，貯存于-70℃冰柜，6個(gè)月內(nèi)有效。（2）體外包裝取包裝物（50μl）置于冰浴上升溫，當(dāng)其正要融化時(shí)加入重組的λDNA，邊融邊攪，充分混勻后，置于37℃保溫60min，加入少量氯仿，離心沉淀雜物。上清液中含有新包裝的噬菌體顆粒，就可用來感染受體細(xì)胞，篩選克隆子。3.2.3.3重組DNA分子通過親本雜交轉(zhuǎn)化大腸桿菌當(dāng)重組DNA分子不能直接轉(zhuǎn)化受體菌時(shí)，可采用三親本雜交（triparentalmating）轉(zhuǎn)化法。被轉(zhuǎn)化的受體菌、含重組DNA分子的供體菌和含廣泛宿主輔助質(zhì)粒的輔助菌三者進(jìn)行共培養(yǎng)，在輔助質(zhì)粒的作用下，重組DNA分子被轉(zhuǎn)移到受體菌細(xì)胞內(nèi)，按照重組DNA分子攜帶的選擇標(biāo)記篩選克隆子。外源DNA通過上述3種方法導(dǎo)入大腸桿菌的技術(shù)已趨于成熟。其中有的方法經(jīng)洗染修改可以用于藍(lán)藻、固氮菌和農(nóng)桿菌等其他原核生物的基因轉(zhuǎn)移。3.2.4重組DNA分子導(dǎo)入真核生物細(xì)胞由于核核生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，適用于原核生物基因轉(zhuǎn)移的方法不能有效地用于真核生物。因此，近年來經(jīng)過探索，發(fā)展了多種適用于植物和動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的方法。3.2.4.1重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞（1）用致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法含有Ti質(zhì)粒的致癌農(nóng)桿菌與一些植物的細(xì)胞接觸后，Ti質(zhì)粒的一部分（T-DNA）可以導(dǎo)入植物細(xì)胞，整合到植物基因組DNA，隨其復(fù)制而復(fù)制。根據(jù)這一特征可構(gòu)建一系列Ti質(zhì)粒載體，與含目的基因的DNA片段重組，導(dǎo)入致癌農(nóng)桿菌，再采用葉盤轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體共培養(yǎng)法和懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)法，通過致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞。葉盤轉(zhuǎn)化法：將實(shí)驗(yàn)植物材料的葉片進(jìn)行表面滅菌，用無菌的打孔器從葉片上取下圓形小片，接種含Ti質(zhì)粒載體重組DNA的致癌農(nóng)桿菌。由圓形小片長(zhǎng)出的愈傷組織通過篩選培養(yǎng)和再分化培養(yǎng)就可以獲得轉(zhuǎn)基因植株。與此類似的方法是將致癌農(nóng)桿菌接種在植物新產(chǎn)生的傷口同樣可獲得轉(zhuǎn)基因植株。原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法：取含Ti質(zhì)粒載體重組DNA的致癌農(nóng)桿菌，同剛再生細(xì)胞壁的植物原生質(zhì)體進(jìn)行短暫的共培養(yǎng)，使重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞，經(jīng)篩選和再分化培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法：此方法類似原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法，不同的是首先建立植物懸浮細(xì)胞系。（2）重組DNA的直接轉(zhuǎn)移法為克服致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的受體局限性，近來發(fā)展了電穿孔法、微彈轟擊法、激光微束穿孔法、多聚物介導(dǎo)法和花粉管通道法等，把重組DNA分子直接導(dǎo)入植物細(xì)胞。采用的克隆載體不限于Ti質(zhì)粒載體。電穿孔法：細(xì)胞膜的基本組成是磷脂，在適當(dāng)?shù)耐饧用}沖電場(chǎng)作用下，細(xì)胞膜被擊穿，但還達(dá)不到細(xì)胞致命傷害。所以當(dāng)移去外加電場(chǎng)后，被擊穿的膜孔可自行復(fù)原。根據(jù)這一性質(zhì)，植物原生質(zhì)體同外源DNA分子混合，置于電擊儀的樣品室中，按預(yù)定的參數(shù)進(jìn)行直流電脈沖處理，再通過常規(guī)的再分化培養(yǎng)和篩選，可獲得轉(zhuǎn)基因植株。為避免制備原生質(zhì)體和原生質(zhì)體再生植株的困難，近來用此技術(shù)直接處理具有完整細(xì)胞壁的植物細(xì)胞、愈傷組織和花粉粒，均取得一定的效果。微彈轟擊法：金屬微粒在外力作用下達(dá)到一定速度后，可以進(jìn)入植物細(xì)胞，但又不引起細(xì)胞致命傷害，仍能維持正常的生命活動(dòng)。利用這一特性，先將含目的基因的外源DNA同鎢、金等金屬微?；靹?，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨后用基因槍轟擊，使DNA隨高速金屬微粒進(jìn)入植物細(xì)胞。此方法可直接處理植物某器官或某組織，是當(dāng)今普遍使用的植物轉(zhuǎn)基因方法。激光微束穿孔法：利用直徑很小、能量很高的激光微束可引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下用激光處理細(xì)胞，處于細(xì)胞周圍的重組DNA隨之進(jìn)入細(xì)胞。此方法最適用于活細(xì)胞中線粒體和葉綠體等細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)移。多聚物介導(dǎo)法：聚乙二醇（PEG）、多聚賴氨酸和多聚鳥氨酸等是協(xié)助DNA轉(zhuǎn)移的常用多聚物，尤以PEG應(yīng)用最廣。這些多聚物同二價(jià)陽離子（Mg2+、Ca2+、Mn2+）和DNA混合，可在原生質(zhì)體表面形成顆粒沉淀，使DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。花粉管通道法：將重組DNA涂于授粉的柱頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具有正常細(xì)胞壁的卵、合子和早期的胚胎細(xì)胞，在活體內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子。此外還有人使用顯微注射法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。3.2.4.2重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物的細(xì)胞不易從周圍捕獲外源DNA，明顯地影響了哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的發(fā)展?？磥硗ㄟ^研究發(fā)展了一系列能有效地將外源DNA分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，主要有以下幾種。（1）病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法由于病毒的種類繁多，用病毒DNA或RNA構(gòu)建的載體性質(zhì)各異，所以轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程各有不同，主要有三種類型：1，帶有目的基因的病毒顆粒直接感染受體細(xì)胞，目的基因隨同病毒DNA分子整合到受體細(xì)胞染色體DNA上；2，帶有目的基因的病毒基因組是缺陷型的，需同另一輔助病毒一起感染受體細(xì)胞；3，雖然帶有目的基因的病毒基因組是缺陷型的，但是被感染的受體細(xì)胞的基因組中已整合了病毒缺失的基因，所以沒有必要用輔助病毒混合感染。（2）用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法哺乳動(dòng)物細(xì)胞能捕獲粘附在細(xì)胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。先將待轉(zhuǎn)染的重組DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，隨后逐滴緩慢地加入Hepers-磷酸鈣溶液中，形成DNA-磷酸鈣沉淀，粘附在培養(yǎng)的細(xì)胞表面上，達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。（3）DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法DEAE-destran（二乙胺乙基葡聚糖）是一種高分子量的多聚陽離子試劑，能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞捕獲外源DNA分子?；静僮鬟^程主要有兩種方式：其一，先使病毒的DNA直接同DEAE-葡聚糖混合，形成DNA-DEAE-葡聚糖復(fù)合物，再處理受體細(xì)胞；其二，受體細(xì)胞先用DEAE-葡聚糖溶液預(yù)處理，隨后再同DNA接觸，也可達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。（4）聚陽離子-DMSO（二甲基亞砜）轉(zhuǎn)染法用聚陽離子（polybrene）處理哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使細(xì)胞表面增加對(duì)外源DNA的吸附能力，再用25%~30%DMSO處理細(xì)胞，增加膜的通透性，提高對(duì)DNA捕獲量，達(dá)到有效的轉(zhuǎn)染。（5）脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體（liposome）是由人工構(gòu)建的碗脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，把用來轉(zhuǎn)染的DNA分子包在其中，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸，將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。包裝成脂質(zhì)體的SV40-DNA的轉(zhuǎn)染率比裸露的DNA的轉(zhuǎn)染率高出100倍。如先用PEG處理培養(yǎng)的受體細(xì)胞，使其易吸收培養(yǎng)基中的脂質(zhì)體，可提高轉(zhuǎn)染率10~20倍。在正常情況下，每個(gè)細(xì)胞平均可吸收1000個(gè)左右的脂質(zhì)體。這是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究中常用的方法之一。（6）顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒于哺乳動(dòng)物細(xì)胞便于注射的特性，常應(yīng)用顯微注射法把外源DNA分子直接注入細(xì)胞。獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的數(shù)量取決于注射的DNA分子。用pBR322/HSV-1tk重組DNA分子注射，轉(zhuǎn)化率不到0.1%，而用連接SV40-DNA某些序列的pBR322/HSV-1tk重組DNA注射，轉(zhuǎn)化率可高達(dá)20%。此外，為便于操作，也可采用“穿剌”法。處于細(xì)胞周圍的DNA隨微針穿剌形成的小孔進(jìn)入細(xì)胞，或隨穿剌的針頭帶入細(xì)胞。（7）電穿孔法

其原理和操作過程類似植物細(xì)胞的電穿孔轉(zhuǎn)移DNA的方法。3.3克隆子的篩選和鑒定受體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)染）或轉(zhuǎn)導(dǎo)處理后，真正獲得目的基因并能有效表達(dá)的克隆一般來說只是一小部分，而絕大部分仍是原來的受體細(xì)胞，或者是不含目的基因的克隆子。為了從處理后的大量受體細(xì)胞中分離出真正的克隆子，已建立了一系列篩選和鑒定的方法，主要有以下幾種方法：3.3.