基因工程-第4章-基因工程載體

第四章基因工程載體載體（vector）是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的ＤＮＡ分子構(gòu)成的一種遺傳成分，通過實驗手段可使其它的ＤＮＡ片段連接在它的上面，而進(jìn)行復(fù)制，作為基因工程的載體，必須具備以下幾個性能：1、分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。2、能獨立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。3、要有盡可能多種限制酶的切割位點，但每一種限制酶又要最少的切割位點（多克隆位點multiplecloningsites，MCS）。4、有適合的標(biāo)記，易于選擇。5、有時還要求載體要能啟動外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。6、從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實驗室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。載體功能克隆載體:

克隆一個基因或DNA片斷表達(dá)載體:

用于一個基因的蛋白表達(dá)整合載體:

把一個基因插入到染色體組中載體來源：質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體真核細(xì)胞克隆載體質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征第一節(jié)質(zhì)粒（plasmid）載體

質(zhì)粒是一種獨立于染色體外的小分子環(huán)狀DNA，一般大小約106～108D，可自身復(fù)制和表達(dá)，有的質(zhì)粒還帶有可做為選擇性標(biāo)記的抗藥性基因，所以質(zhì)粒經(jīng)過適當(dāng)改造后便可成為良好的載體。作為載體的質(zhì)粒大多是由天然質(zhì)粒經(jīng)人工適當(dāng)改造而成的，目前已有多種經(jīng)改造的良好的質(zhì)粒載體。

質(zhì)粒（plasmid）

是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對。常有1～

3個抗藥性基因，以利于篩選。質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲存。主要是DNA水平上的操作。基因表達(dá)的質(zhì)粒載體允許外源DNA的插入、儲存和表達(dá)。一、質(zhì)粒的生物學(xué)特性：1、質(zhì)粒DNA的構(gòu)型：

SC型共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA）OC型開環(huán)DNA（ocDNA）L型線性DNA（LDNA）

2、不同質(zhì)粒的分子量大小差異相當(dāng)顯著：

106～

108D

3、作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分：復(fù)制基因（replicator）、選擇性記號、克隆位點

LOCSC4、質(zhì)粒DNA編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀。

抗性特征、代謝特征、修飾寄主生活方式的因子等。5、質(zhì)粒DNA的類型：接合型和非接合型；含大腸桿菌素Col質(zhì)粒和含抗菌素抗性基因的R質(zhì)粒；F因子和F`因子等。按接合轉(zhuǎn)移功能分類主要基因按抗性記號分類非接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，產(chǎn)生大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)接合型質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，細(xì)菌染色體區(qū)段F質(zhì)粒（F因子）自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Col質(zhì)粒自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，抗菌素抗性基因R質(zhì)粒(R因子)自主復(fù)制基因，轉(zhuǎn)移基因，大腸桿菌素基因Ent質(zhì)粒6、質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型：

低拷貝的質(zhì)粒（1～3）：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（接合型）高拷貝的質(zhì)粒（10～60）：松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（非接合型）

7、質(zhì)粒的不親合性

在同一個大腸桿菌細(xì)胞，一般不能同時含有兩種不同的。也稱為質(zhì)粒的不相容性。是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。質(zhì)粒的不親合性分子基礎(chǔ)，主要是由于它們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成的。二、質(zhì)粒載體的構(gòu)建與類型

1.

天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。在大腸桿菌中，常見的可用于基因克隆的天然質(zhì)粒有ColE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，它含有一個EcoRI酶切位點，一個四環(huán)素抗性選擇記號（Tetr），插入外源片斷后不影響其復(fù)制功能，但該質(zhì)粒分子量較大，拷貝數(shù)低只具有抗菌素抗性基因，無法使用插入失活技術(shù)選擇重組分子。ColE1質(zhì)粒在其唯一的單切割位點EcoRI中克隆外源DNA片斷后，可根據(jù)對大腸桿菌素E1的免疫性選擇轉(zhuǎn)化子，不能合成大腸桿菌素E1的菌落是具有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。但對大腸桿菌素E1的免疫篩選，在化學(xué)上是相當(dāng)麻煩的。2.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件(1)、具有復(fù)制起點；

自我增值的基本條件，一般具一個復(fù)制子。

(2)

、具有抗菌素抗性；

理想的質(zhì)粒載體具有兩種抗菌素抗性基因。

(3)、具有若干限制酶切單一位點（CMS）；(4)、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。

低分子量的質(zhì)粒易于操作，克隆外源片斷后仍能有效的轉(zhuǎn)化給受體細(xì)胞同時低分子量的質(zhì)粒對限制酶具有多種識別位點的幾率也較低；較高的拷貝數(shù)可獲得大量的克隆基因以Ampr和Tetr為選擇性標(biāo)記，克隆位點在這兩個選擇性標(biāo)記的單酶切位點上。選擇AmprTets或AmpsTetr的重組子。（4363bp）3.質(zhì)粒載體的選擇記號新陳代謝特性；對大腸桿菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；

四環(huán)素抗性、氨芐青霉素抗性、鏈霉素抗性、卡那霉素抗性大多數(shù)質(zhì)粒本身帶有抗菌素基因；抗菌素抗性記號便于操作、易于選擇。三、重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體1、pSC101質(zhì)粒載體；2、ColE1質(zhì)粒載體；3、pBR322質(zhì)粒載體；4、pUC質(zhì)粒載體；

1.pSC101質(zhì)粒載體一種嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制控制的拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。平均每個寄主細(xì)胞僅有1～2個拷貝；分子量9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（tetr

）。有HindIII、EcoRI、BamHI、SalI、XhoI、PvuII、SmaI等7種核酸內(nèi)切限制酶。其中在HindIII、BamHI和SmaI等3個位點克隆外源DNA，都會導(dǎo)致tetr基因失活。是第一個真核生物的克隆載體。2.ColE1質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制控制的多拷貝的質(zhì)粒，能產(chǎn)生細(xì)菌素。細(xì)菌素對大腸桿菌的正常生命活動有抑制作用（復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯能量代謝等）。但含有對細(xì)菌素的免疫基因。3.pBR322質(zhì)粒載體“P”表示是一種質(zhì)粒；“BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示實驗編號。pBR322的構(gòu)建：為改進(jìn)轉(zhuǎn)化子篩選技術(shù)，并具有相對小的分子量、高拷貝數(shù)、外源基因插入不影響質(zhì)粒的復(fù)制功能、多克隆位點（多種限制酶的單一切割位點）、質(zhì)粒的穩(wěn)定性（克服質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力）

pBR322的結(jié)構(gòu)來源pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點：1、具有較小的分子量；

它的分子量為4363bp。克隆載體的分子量大小不要超過10kb。2、具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。

pBR322DNA分子中總共有24種核酸內(nèi)切酶只具有單一的酶切識別位點。其中7種內(nèi)切酶的識別位點在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2種識別位點在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，所以9個限制酶切位點插入外源片斷可以導(dǎo)致tetr

基因的失活；另外有3種限制酶在氨芐青霉素抗性基因有單一的識別位點，

3、具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增之后每個細(xì)胞中可積累1000～3000個拷貝。

pBR322質(zhì)粒載體的改良為了更加實用，人們對pBR322質(zhì)粒進(jìn)行了改良，得到許多pBR322質(zhì)粒衍生質(zhì)粒，它們各自具有不同的特點。4.

pUC質(zhì)粒載體人們應(yīng)用多克隆位點技術(shù)，在pBR322的基礎(chǔ)上，組入了一個在其5’-端帶有一段多克隆位點的lacZ’基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。

一種典型的pUC系列的質(zhì)粒載體，包括以下四個部分：

1、來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點（ori）；

2、氨芐青霉素抗性基因（ampr）,但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的識別位點。

3、大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)稱之為lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。AmproripUC18(3kb)MCS

(Multiplecloningsites, 多克隆位點）LacpromoterlacZ’pUC質(zhì)粒載體的形體圖pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點第一，具有較小的分子量和更高的拷貝數(shù);

僅保留了pBR322的氨芐青霉素抗性基因和復(fù)制起點；在操作過程中復(fù)制起點內(nèi)部發(fā)生了自發(fā)突變造成了基因rop的缺失，它是控制質(zhì)粒的特殊因子，從而使拷貝數(shù)增加，平均每個細(xì)胞500~700個拷貝。第二，適用于組織化學(xué)檢測重組體；具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補(bǔ)作用，用Xgal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷）顯色對重組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。第三，具有多克隆位點MCS區(qū)段．方便，具有不同粘性末端的外源片斷的插入。第二節(jié)噬菌體載體（Bacteriophage，簡稱phage）

一、噬菌體的一般生物特性

可脫離寄主細(xì)胞生存，但不能進(jìn)行復(fù)制。除了對寄主的依賴性，還具備其它的功能：1、保護(hù)自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的破壞；2、將其核苷酸分子注入到被感染的細(xì)菌細(xì)胞；3、將被感染的細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成制造噬菌體的體系，從而長生出大量的子代噬菌體顆粒；4、使感染的細(xì)菌細(xì)胞釋放出子代的噬菌體顆粒1.噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型：結(jié)構(gòu)：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、線狀體型核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNA、雙鏈環(huán)形DNA、單鏈環(huán)形DNA、單鏈線形DNA、單鏈RNA。2.噬菌體的溶菌生命周期

噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長的基本過程：1、吸附吸附到位于感染細(xì)胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌體DNA穿過細(xì)胞壁注入寄主細(xì)胞3、轉(zhuǎn)變被感染的細(xì)胞成為制造噬菌體顆粒的場所4、合成大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)5、組裝包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放合成的子代噬菌體顆粒從寄主細(xì)胞內(nèi)釋放出來

3.噬菌體的溶源生命周期溶源生長周期：是指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體的DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個組成部分。

二、λ噬菌體載體λphage48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)溶菌階段(復(fù)制和釋放)溶源階段

(整合到寄主染色體上)λ噬菌體載體的主要類型1.插入式載體一種只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點的派生載體。2.替換型載體（取代型載體）

具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。3.凱倫噬菌體載體插入式載體：

λ噬菌體載體相對于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構(gòu)建。cI基因（λ阻遏蛋白基因）插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

cIEcoRILA32.7RA10.6λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRICharon16Aλ替換型載體（取代型載體）外源DNA取