《生物工業(yè)分析》課件第六章

生物工業(yè)分析第六章色層分析法第一節(jié)概述第二節(jié)柱層析第三節(jié)紙上層析第四節(jié)薄層層析第五節(jié)凝膠層析色層分析法第一節(jié)

概述

色層分析法簡稱層析法，也稱色譜法、層離法等。①按兩相所處的狀態(tài)分類：用液體作為流動(dòng)相的稱為“液相色譜”，用氣體作為流動(dòng)相的稱為“氣相色譜”?？紤]到固定相的物態(tài)，液相色譜又分為“液液色譜”和“液固色譜”，氣相色譜又分為“氣液色譜”和“氣固色譜”。

②按固定相使用形式分類：可分為柱層析、紙層析、薄層層析。

③按分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)分類：可分為分配層析、吸附層析、離子交流層析、凝膠層析、親和層析等。

④按洗脫方式分類：可分為洗脫法、迎頭法、置換法。

色層分析法第二節(jié)柱層析一、吸附柱層析

1．原理吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)吸附力的差別而達(dá)到分離的方法。圖6-1二元混合物的柱層析圖

色層分析法吸附柱層析的過程可簡要說明如下：裝置如圖6-1⑴，用一根玻璃管，底部放些棉花或玻璃纖維，管中填入吸附劑（如氧化鋁的粉末），這樣就形成了一個(gè)吸附柱。然后在頂部加入待分離的樣品溶液，設(shè)樣品內(nèi)含有兩種組分A和B，則兩者都被吸附劑留在柱的上端形成一個(gè)色帶。圖6-1⑵⑶，圖中的虛線是溶液中溶劑前沿到達(dá)的地方。樣品溶液全部流入吸附柱中后，接著就加入純?nèi)軇_洗，管內(nèi)就連續(xù)不斷地發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。例如被吸附的A組分被溶劑所解吸而隨溶劑向下移動(dòng)時(shí)，又遇到新的吸附劑顆粒，重新把A自溶液中提出而被吸附，當(dāng)繼續(xù)流下的新溶劑再次把A解吸向下移動(dòng)，然后再被吸附，這樣經(jīng)過一段時(shí)間以后，A就會向下移動(dòng)至一定距離。同理B也向下移動(dòng)，由于溶劑及吸附劑兩者對A與B的角吸力與吸附力不同，A與B所移動(dòng)的距離也就不同。吸附力較弱的與解吸力較強(qiáng)的組分（如A），移動(dòng)距離也就大些，經(jīng)過適當(dāng)時(shí)間以后，A和B就可以安全分開，形成兩個(gè)區(qū)帶，每一區(qū)帶內(nèi)是一種純物質(zhì)。如果A與B有顏色，就可清楚地看到色帶，如圖6-1⑷⑸。加入的溶劑稱為“洗脫劑”，沖洗過程稱為“洗脫”或“展開”，管下流出的液體稱為“流出液”或“洗脫液”。

色層分析法2．流出曲線圖6-2不同洗脫方式的流出曲線

色層分析法①洗脫法流出曲線如果洗脫劑采用純?nèi)軇?，并連續(xù)不斷地洗脫，最初流出的為純?nèi)軇?，爾后是吸附力較弱的組分A，最后為吸附力較強(qiáng)的組分B，得到的流出曲線見圖6-2⑴。洗脫法優(yōu)點(diǎn)是分離效能高，能得到純組分溶液，適用于多組分混合物的分離，它是目前層析法中最常用的方法。②迎頭法流出曲線如果洗脫劑為原試樣溶液，則最初流出的為純?nèi)軇?，?dāng)流過一定體積的試樣溶液后，吸附力較弱的組分A在吸附柱中被飽和，組分A就開始流出，其濃度要比原試樣溶液中組分A的濃度為高。緊接著吸附力較強(qiáng)的組分B在吸附柱中被飽和，組分B也開始流出，此時(shí)收集的流出液組成與原試樣溶液完全相同，見圖6-2⑵。迎頭法只能得到較純的組分A，它不是一個(gè)理想的分離方法，僅用作混合物的分析研究之用。色層分析法③置換法流出曲線如果洗脫劑是一種溶液，內(nèi)含有吸附力更強(qiáng)的組分，稱為“置換劑”，同樣道理，得到的流出曲線為圖6-2⑶。置換法能達(dá)到組分A與組分B分離的目的，但臨接部分則互相混雜。

3．吸附劑能作為吸附劑的，需滿足下列要求：①吸附劑要具有合適的吸附力，表面積大，通常呈粉末狀或纖維狀。②吸附劑顆粒均勻，否則不能得到均一的色層譜。③吸附劑與吸附物質(zhì)的吸附、解吸應(yīng)是可逆的。④吸附劑不應(yīng)含有雜質(zhì)，否則需經(jīng)預(yù)處理后使用，通常可用有機(jī)溶劑浸泡以除去雜質(zhì)。

色層分析法用作吸附劑的材料很多，可分為無機(jī)吸附劑與有機(jī)吸附劑，常用的無機(jī)吸附劑有氧化鋁、碳酸鈣、氧化鈣、氧化鎂、氧化鋅、磷酸氫鈣、硅酸、活性炭等。有機(jī)附吸附劑有蔗糖、乳糖、淀粉、菊根粉、纖維素等。按其吸附力的大小分為弱、中、強(qiáng)三類，見表6-1。

表6-1吸附劑按吸附力分類

色層分析法4．洗脫劑洗脫劑的選擇一般需要考慮以下幾個(gè)方面：①首先需考慮樣品在溶劑中溶解度。②溶劑一般需無水溶劑，而且不與水互溶。③溶劑的沸點(diǎn)要適宜，一般講溶劑沸點(diǎn)以40～80℃為宜。④溶劑純度要高，溶劑中即使是微量雜質(zhì)的存在，有時(shí)也可明顯地改變吸附性質(zhì)。⑤當(dāng)一種溶劑對某一物質(zhì)吸附作用過強(qiáng)時(shí)，則洗脫困難，過弱時(shí)不能產(chǎn)生滿意的色譜圖，這種情況下可采用按一定比例制備多元混合溶劑系統(tǒng)，以調(diào)整洗脫能力。一些常用溶劑的洗脫能力見表6-2。

色層分析法表6-2一些常用溶劑的洗脫能力

色層分析法二、分配柱層析分配柱層析是利用各組分在兩種不相混溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而得到分離，它相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑抽提法。1．分配系數(shù)K一定量的溶質(zhì)在兩種不相溶的溶劑中達(dá)到平衡時(shí)，溶質(zhì)在兩種溶劑中的濃度比值為一常數(shù)，此常數(shù)稱為分配系數(shù)。

色層分析法2．分配柱層析原理為便利研究，假設(shè)分配柱是由兩迭并列的小方盒組成，見圖6-3，其中S行代表固定相，M行代表流動(dòng)相，兩相互不混溶。假設(shè)溶質(zhì)在各盒之間能左右相通，而溶質(zhì)在上下各層之間則不能通過。當(dāng)分配達(dá)到平衡后，設(shè)A物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的濃度比為1﹕1（K=1），B為1﹕3（K=1/3）。將A、B各1分加到第一層小盒S中，平衡后，A在S和M中各為1/2，B在S中為1/4，而在M中為3/4。而后使M行向下移一層，再達(dá)平衡后，A在第一層和在第二層M和S中均為1/4，而B在第一層S和M中分別為1/16和3/16，在第二層S和M中分別為3/6和9/16，見6-4。如此重復(fù)操作10次，將A、B在各層中的量列于表6-3中，若以物質(zhì)的分?jǐn)?shù)對層數(shù)作圖，則得圖6-5⑴，重復(fù)操作20次，如圖6-5⑵，重復(fù)操作30次，如圖6-5⑶。可以看出，A與B最濃部分已經(jīng)分開。如再繼續(xù)下去，A與B就可完全分離。應(yīng)該指出，在實(shí)際操作時(shí)，溶劑的加入是連續(xù)不斷的，不是象上面例子中一層一層地向下移動(dòng)。

色層分析法圖6-3假想的分配層析中固定相和流動(dòng)相分配情況

色層分析法表6-3提取10次后A與B在固定相和流動(dòng)相中的分配

色層分析法圖6-4兩種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配

色層分析法圖6-5A與B提取次數(shù)增加而逐漸分離示意圖

色層分析法3．移動(dòng)速率R在層析法中（見圖6-6），一般以R值來代表某種物質(zhì)的移動(dòng)速率，其定義為：色層分析法圖6-6層析柱中色帶移動(dòng)情況

色層分析法近來一般都常用Rf值來表示物質(zhì)的移動(dòng)速度，其定義為：Rf值決定于被分離物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)和兩相間的體積比。

由于兩相體積比在同一試驗(yàn)中是一常數(shù)，所以主要取決于分配系數(shù)K。在紙層析中常以Rf值來表示移動(dòng)速率。

色層分析法4．固定相與流動(dòng)相在分配柱層析中，固定相一般由支持劑和溶劑組成。支持劑要求是化學(xué)惰性，沒有吸附能力，但能吸留大量的固定相液體。通過使用的支持劑有硅膠、硅藻土類、纖維素、淀粉等。固定相液體通常是水溶液或與水混合的液體，常用的有水、各種緩沖溶液、甲酰胺、丙二醇、以及它們的混合液等，按一定比例與支持劑混合后填裝層析柱。流動(dòng)相一般采用有機(jī)溶劑。如果以有機(jī)溶劑為固定相，水溶液為流動(dòng)相，則稱為“反相分配層析”。固定相與流動(dòng)相的選擇，一般是根據(jù)樣品組分在兩相間的溶解度，即分配系數(shù)而定。

色層分析法三、離子交換柱層析1.離子交換樹脂（1）陽離子交換樹脂①強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂：含有—SO3H或—CH2SO3H等活性基團(tuán)，如732。②弱酸性陽離子交換樹脂：含有—COOH或—OH等活性基團(tuán)，如724。（2）陰離子交換樹脂①強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂：含有銨鹽≡N+OH-活性基團(tuán)，如717。②弱堿性陰離子交換樹脂：含有伯胺—NH2、促胺=NH、叔胺≡N等活性基團(tuán)，如701。

常用的國產(chǎn)離子交換脂見表6-4。

色層分析法產(chǎn)品牌號交換基團(tuán)出廠離子形式形狀粒度（目）水分（%）視比重（克/毫升）總交換當(dāng)量（毫克當(dāng)量/克）最高操作溫度（℃）有效范圍pH膨脹率（%）主要用途生產(chǎn)單位國外同類產(chǎn)品強(qiáng)酸1×7（732）-SO3MNa型球狀16-5040-520.75-0.85≥4.5120（Na型，H型）0-14

水處理及稀土元素分離等上海樹脂廠（美）AmberliteIR-120（日）タィャィォソSKIB粉末強(qiáng)酸1×8-SO3MNa型球狀100-20044-50

4.8120（Na型，H型）0-14

核苷酸類物質(zhì)分離提純等上海化工學(xué)院（美）AmberliteIR-200大孔型強(qiáng)酸1號-SO3MNa型球狀16-50

4.0130-150（H型，Na型）0-14Na→H2水處理，三廢處理等南開大學(xué)，上海樹脂廠等（美）Amberlite200強(qiáng)堿201×7（717）—N（CH3）3XCI型球狀16-5040-500.65-0.75≥3.070（CI型）60（OH型）0-14

純水制備等上海樹脂廠等（美）AmberliteIRA-400（日）タィャィォソSA10A粉末強(qiáng)堿201×8—N（CH3）3XCI型球狀100-20040-50

≥3.070（CI型）60（OH型）0-14

核苷酸類物質(zhì)分離提純等上?；W(xué)院（美）AmberliteIRA-400表6-4

國產(chǎn)離子交換樹脂牌號及規(guī)格性能

色層分析法產(chǎn)品牌號交換基團(tuán)出廠離子形式形狀粒度（目）水分（%）視比重（克/毫升）總交換當(dāng)量（毫克當(dāng)量/克）最高操作溫度（℃）有效范圍pH膨脹率（%）主要用途生產(chǎn)單位國外同類產(chǎn)品弱酸101×128（724）—COOH（甲基丙烯酸型）H型球狀16-50≤60

≥9

5-14H→Na

抗菌素提純等上海樹脂廠等（美）AmberliteIRA-50（蘇）K5-4∏2弱酸122—COOH，—OH（苯酚，水，酸，甲醛型）

球狀16-50

≥3.9

味精脫鐵，提取維生素B12等南開大學(xué)等

弱堿330（701）伯、仲、叔胺基（環(huán)氧型）OH型球狀16-50≤650.60-0.75≥950（OH型）0-9

水處理及糖液脫色等上海樹脂廠等（蘇）3д3-10∏（美）DuoliteA-30B弱堿311×2（701）伯、仲、叔胺基（環(huán)氧型）CI型球狀16-5045-55

≥5.0

水處理及抗菌素提煉等上海樹脂廠等（美）AmberliteIR-45注：表中所列樹脂母體結(jié)構(gòu)未加注明者皆為苯乙烯型。

色層分析法2．離子交換樹脂親和力一般說來，在稀的水溶夜中，親和力隨離子的價(jià)數(shù)與原子序數(shù)增加而增加，但隨水化離子半徑的增加而降低。強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂對各種離子的親和力次序如下：①Fe3+＞Al3+＞Ca2+＞Mg2+＞K+＞Na+＞H+＞Li+＞（CH3）4N+②La3+＞Y3+＞Ba2+＞Cs+＞Rb+＞K+＞Na+＞H+＞Li+③Zn2+＞Cu2+＞Ni2+＞Co2+＞Fe2+＞Ba2+＞Sr2+＞Ca2+＞Mg2+弱酸性陽離子交換樹脂對氫離子的親和力特別高，因此再生為氫型時(shí)僅需很少量的酸。色層分析法強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂對各種離子的親和力次序如下：檸檬酸根＞SO42-＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞OH-＞F-＞CH3COO-弱堿性陰離子交換樹脂對氯氧根離子有較高的親和力。對各種酸的親和力次序如下：芳香磺酸＞檸檬酸＞鉻酸＞硫酸＞酒石酸＞草酸＞磷酸＞砷酸＞鉬酸＞硝酸＞氫碘酸＞氫溴酸＞硫氰酸＞鹽酸＞氫氟酸＞甲酸＞乙酸＞碳酸

離子交換柱層析法就是利用各種離子對離子交換樹脂的親和力的不同而達(dá)到分離的目的。色層分析法3．離子交換柱層析操作在層析柱內(nèi)放入離子交換樹脂，再將樣品溶液通過，一些性質(zhì)相近的離子就被離子交換樹脂所吸留。用水洗去殘液后，再用洗脫劑來洗脫。在洗脫過程中，就發(fā)生一連串的洗脫交換和吸留交換現(xiàn)象，離子也因此向下移動(dòng)，親和力大的離子被吸留得比較牢固，因此移動(dòng)得慢，親和力小的離子被吸留的力量小，容易被洗脫下來，就移動(dòng)得快，這樣，樣品中不同的離子就被分離。

離子交換能力的大小，確切地說，是樣品中離子在樹脂與洗脫劑之間的分配系數(shù)Ｋ的不同。色層分析法

分析用的離子交換樹脂顆粒要比其他用途的樹脂顆粒小，直徑一般為0.05～0.30毫米（270～52目）。上柱的樣品必須小于突破量（實(shí)際交換當(dāng)量）*。層析柱直徑與長度之比有時(shí)可降低到1﹕100，甚至1﹕200，這樣溶液通過的距離長，分離效果好，但洗脫液的流動(dòng)速率就較慢。氨基酸自動(dòng)分析儀是離子交換層析的具體應(yīng)用。它主要有層析柱，配合有蠕動(dòng)泵、開關(guān)閥、塑料管道、保溫槽、自動(dòng)比色計(jì)、記錄器及程序控制器等。層析柱中裝有徽球形交聯(lián)聚苯乙烯磺酸樹脂，樣品溶液加入后，用不同pH的檸檬酸緩沖液作用洗脫劑，可將多種氨基酸分離，經(jīng)茚三酮顯色，比色并定性與定量。其原理如圖6-7，分析實(shí)例如圖6-8。

色層分析法色層分析法色層分析法四、柱層析的使用裝置與操作吸附、分配、離子交換柱層析中，所用儀器通常采用玻璃柱，內(nèi)徑為1～5厘米，長約15～60厘米。管下端放一層脫脂棉、玻璃絲或砂芯濾板，如圖6-9。將樣品溶液由柱的上端緩慢加入，樣品溶液的濃度應(yīng)高些，以減少上柱樣品溶液的體積，待樣品溶液完全上柱后，即可用洗脫劑進(jìn)行洗脫，并在層析柱下端收集洗脫液，一般采用自動(dòng)部分收集器。這樣可以收集到許多部分洗脫液，然后再對收集液進(jìn)行定量分析。

色層分析法色層分析法第三節(jié)紙上層析

一、原理紙上層析的操作是在一張?zhí)刂频臑V紙上，一端點(diǎn)樣要分離的樣品溶液，放在密閉容器內(nèi)，使溶劑從有樣品的一端析向另一端，從而使樣品中的混合物得到分離。再通過顯色，使分離后的各物質(zhì)在濾紙的各個(gè)不同位置上顯示出來。如圖6-10所示。

紙上層析是一種分配層析，是利用各組分在兩種不相混溶的溶劑中分配系數(shù)不同而得到分離。

紙上層析雖屬于分配層析，但有時(shí)也有吸附和弱陽離子交換的現(xiàn)象發(fā)生。

色層分析法圖6-10紙上層析圖譜

色層分析法二、操作方法和操作條件的選擇

1．層析濾紙（1）對濾紙的要求①物理性狀均勻。②具有一定的機(jī)械強(qiáng)度。濾紙被溶劑潤濕后仍能站立不倒。③纖維松緊程度適度。溶劑展開速度合適。纖維過于疏松,則斑點(diǎn)易擴(kuò)散，如過于緊密,則展開時(shí)間過長。④具有一定純度。

⑤濾紙上不應(yīng)含有溶于水及有機(jī)溶劑的物質(zhì)。

色層分析法（2）濾紙的選用

快速濾紙的纖維疏松，展開速度快，但斑點(diǎn)較易擴(kuò)散，故適于分離Rf值差別較大的樣品或急于了解結(jié)果時(shí)采用。慢速濾紙展開速度慢，但斑點(diǎn)緊密，適于較難分離的樣品以及定量分析用。在一般情況下，定性分析常用較薄的濾紙，定量分析和制備分析時(shí)常用較厚的濾紙。

濾紙都具有方向性。溶劑在紙的縱橫兩個(gè)方向的流速不相同，縱向（順機(jī)方向）的流速快、橫向（逆機(jī)方向）的流速慢。在進(jìn)行單向展開時(shí)，一般以縱向展開為宜。

色層分析法品名重量（克/米2）厚度（毫米）灰粉（%）性能新華濾紙1號2號3號4號5號6號9090901801801800.170.160.150.340.320.300.080.080.080.080.080.08慢速,薄紙中速,薄紙慢速,薄紙快速,厚紙中速,厚紙慢速,厚紙

S.S.589G140-1450.25-0.28—快速,厚紙Whatman1號2號3號4號85-9095-10018590-950.160.180.360.190.027—0.0750.15中速,薄紙中速,薄紙中速,厚紙快速,薄紙表6-5一些層析濾紙的規(guī)格與性能

色層分析法2.溶劑系統(tǒng)（1）溶劑系統(tǒng)的組成展開的溶劑往往采用兩種、三種或三種以上的溶劑，按一定比例配制成多元溶劑系統(tǒng)。在多元溶劑系統(tǒng)中，各組分按其性能大致可分為三類。第一類溶劑對被分離物質(zhì)的溶解度很小，溶劑對被分離物質(zhì)的溶解度很大，第三類溶劑用來調(diào)節(jié)各組分之間的比例或調(diào)節(jié)整個(gè)溶劑系統(tǒng)的pH值。一般在一個(gè)溶劑系統(tǒng)中，第一類溶劑的量占主要地位，第二類溶劑的量取決于被分離物質(zhì)的效應(yīng)，如含量太多則使被分離組分的Rf值都趨近于1，太少則使Rf值都很小，而達(dá)不到分離目的。因此第二類溶劑的量要適當(dāng)，使各個(gè)被分離組分能均勻地分布在濾紙上。色層分析法（2）溶劑系統(tǒng)的選用①被分離物質(zhì)在該溶劑系統(tǒng)中的Rf值在0.05-0.85之間，兩個(gè)相鄰物質(zhì)的Rf值之差應(yīng)大于0.05。②溶劑系統(tǒng)與被分離物質(zhì)之間應(yīng)不起化學(xué)反應(yīng)。③被分離物質(zhì)在該溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)量最好不受或少受溫度變化的影響，并在兩相中的分配能迅速達(dá)到平衡，這樣易得到較為圓整的斑點(diǎn)。④溶劑系統(tǒng)不應(yīng)減弱顯色劑的靈敏度。⑤揮發(fā)性較好，使濾紙?jiān)谡归_后易于干燥。溶劑系統(tǒng)的正確選擇是試樣與混合物能否分離的關(guān)鍵，一般可根據(jù)試樣中所含的各組分，先查閱有關(guān)文獻(xiàn)，選擇Rf值相差較大的溶劑系統(tǒng)來展開。紙上層析中，較多使用的正丁醇溶劑系統(tǒng)。

色層分析法3.操作方法（1）點(diǎn)樣取一張大小合適的層析濾紙，用鉛筆在距紙底邊2-3cm處輕輕劃一直線（稱為點(diǎn)樣線），紙上每隔開2cm處標(biāo)上一個(gè)點(diǎn)，然后用點(diǎn)樣器（定性分析可用毛細(xì)管，定量分析可用微量進(jìn)樣器，見圖6-11），將樣品溶液輕輕點(diǎn)在濾紙的畫點(diǎn)處，點(diǎn)的擴(kuò)散時(shí)間與被分離物質(zhì)的性質(zhì)來決定，一般為10-30ug試樣溶液濃度為1%左右。濃度太大，則斑點(diǎn)易拖尾，太稀則不易檢出。因此，對于太濃的試樣應(yīng)予稀釋，太稀的試樣可采用濃縮或多次點(diǎn)樣，但每點(diǎn)一次后必須用冷風(fēng)或溫?zé)岽蹈?，然后再點(diǎn)下一次。每次的點(diǎn)樣位置要重合，否則會使斑點(diǎn)畸形。

色層分析法（2）展開展開前應(yīng)先將層析缸與濾紙用溶劑的全部組分的蒸汽來飽和，這個(gè)飽和過程稱為“平衡”。（a）毛細(xì)管（b）微量注射器圖6-11點(diǎn)樣器

色層分析法

展開操作是將溶劑加入層析缸內(nèi)，然后將點(diǎn)樣后的濾紙放入缸內(nèi)，但勿接觸溶劑，密閉層析缸進(jìn)行“平衡”，平衡時(shí)間一般為1-24小時(shí)不等。平衡后，讓濾紙與溶劑接觸，使溶劑液面距濾紙?jiān)€約1cm左右，此時(shí)即進(jìn)行展開。當(dāng)溶劑前沿到達(dá)距濾紙另一端0.5-1cm時(shí)，取出濾紙，用鉛筆在溶劑前沿處作上記號，晾干（或用冷風(fēng)吹干）。

展開方式按溶劑在濾紙上的流動(dòng)方式不同，可分為上升法（上行法）、下降法（下行法）、水平法（環(huán)形或圓形法）三種。實(shí)際工作中上升法最常用。圖6-12為上升法的裝置圖。此法操作簡便，重現(xiàn)性較好。

色層分析法圖6-12上升法展開裝置

色層分析法如果物質(zhì)的Rf值較小，則可采用下降法，也可采用上升法“多次展開法”。多次展開法是將展開后的濾紙取出，晾干，再在相同的條件下進(jìn)行展開，以增加分離效果。如果樣品溶液中所含組分較多，用一種溶劑系統(tǒng)展開不能全部分離時(shí)，則可采用“雙向?qū)游龇ā?。即在一張方形的濾紙一角處點(diǎn)樣，先用一種溶劑系統(tǒng)展開，然后再用將濾紙轉(zhuǎn)動(dòng)900，再用另一種溶劑系統(tǒng)展開。雙向?qū)游龇ǖ狞c(diǎn)樣量要比單向?qū)游龆嘁槐蹲笥摇?/p>

色層分析法（3）顯色

①顯色劑顯示方法利用顯色劑與被分離物質(zhì)形成有顏色化合物，用于鑒別物質(zhì)的位置。顯色劑要求顯色靈敏度高，而配制顯色劑時(shí)盡可能采用揮發(fā)性高并與水不相混合的溶劑，以免斑點(diǎn)擴(kuò)散。顯色方法可采用嘴霧法和浸漬法。顯色后的圖譜一般很易褪色，故應(yīng)立即用鉛筆畫出紙上斑點(diǎn)位置?；虿捎貌噬障啾４妗?/p>

②紫外線顯示法有些物質(zhì)本身具有熒光性質(zhì)，在暗箱中紫外線照射下可以觀察到明顯的熒光。有些物質(zhì)具有紫外線吸收性質(zhì)，在紫外線照射下出現(xiàn)暗色斑點(diǎn)。此外，也可噴入熒光物質(zhì)，然后在紫外線照射下觀察物質(zhì)所吸收的暗斑。

色層分析法三、定性、定量分析

1．定性分析（1）Rf值的測量樣品經(jīng)展開并顯色后，物質(zhì)在圖譜上的位置可用Rf值表示，見圖6-13。如果采用下降層析法時(shí)，沒有溶劑前沿，則可采用某一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所移動(dòng)的距離作為參照。如在糖類的下降層析時(shí)，以葡萄糖所移動(dòng)的距離為標(biāo)準(zhǔn)，則可用比移值RG來表示，如圖6-14所示。

色層分析法圖6-13Ｒf值的測量圖6-14RG值的測量

色層分析法（2）定性鑒定物質(zhì)移動(dòng)的距離主要決定于該物質(zhì)在固定相及流動(dòng)相中的分配系數(shù)，各種不同的物質(zhì)，因它們在兩相中的分配系數(shù)不同，而Rf也不相同，因此測定物質(zhì)的Rf值即可進(jìn)行定性鑒定。表6-6、6-7、6-8列舉了一些Rf值。在鑒定未知物質(zhì)時(shí)，必須用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在同一張濾紙上同時(shí)展開，比較它們的Rf值是否一致。

色層分析法

溶劑系統(tǒng)

氨基酸酚

7水

3水飽和三甲基

吡

啶正丁醇

4

乙酸1水2水飽和正丁醇甘氨酸丙氨酸纈氨酸亮氨酸異亮氨酸苯丙氨酸脯氨酸絲氨酸蘇氨酸酪氨酸羥脯氨酸天冬氨酸谷氨酸胱氨酸蛋氨酸組氨酸精氨酸賴氨酸0.400.600.740.860.870.900.890.350.470.660.660.120.200.130.830.500.480.430.330.410.350.650.620.670.410.370.420.540.420.140.160.200.610.240.150.140.320.390.530.730.700.650.420.280.350.560.300.260.320.110.560.250.140.120.050.320.450.580.450.430.120.050.070.280.080.000.260.000.260.040.010.00表6-6一些氨基酸的Rf（上升法）

色層分析法溶劑系統(tǒng)脂肪酸（銨鹽）95%乙醇100濃氨水正丁醇以1.5mol/L

氨水飽和甲酸乙酸丙酸丁酸戊酸己酸庚酸辛酸壬酸0.310.330.440.540.600.680.720.76----0.100.110.190.290.410.530.620.650.67表6-7揮發(fā)性脂肪酸銨鹽的Rf（上升法）

色層分析法溶劑系統(tǒng)

有機(jī)酸正丁醇1甲酸

2水

15正戊醇

15mol/L甲酸1乙醚588%甲酸2水

1乙醇80濃氨水5水

15乳酸丙酮酸草酸琥珀酸順丁烯二酸反丁烯二酸衣康酸蘋果酸酒石酸草酰乙酸ɑ-酮戊二酸烏頭酸檸檬酸0.770.630.050.720.460.86----0.440.230.610.560.780.370.620.650.140.610.530.790.710.320.14----0.480.660.230.800.830.180.790.78----0.820.550.33-----0.69----0.460.48----0.020.140.130.17------0.090.06-----0.080.020.02表6-8一些揮發(fā)性有機(jī)酸的Rf值

色層分析法（3）影響Rf值的因素①濾紙影響不同型號的濾紙，它們的厚薄與纖維松緊程度各不相同，因此能吸著的水量也不相同,即使是使用同一溶劑系統(tǒng)，也因固定相與流動(dòng)相的比例不同，而使Rf值不相同。此外，濾紙本身的pH值對Rf值也有一定影響.②溶劑系統(tǒng)影響同一物質(zhì)用不同溶劑系統(tǒng)來展開時(shí)，所得的Rf值也不同，同一溶劑系統(tǒng)內(nèi)各組分比例不同其Rf值也有差異，這是因?yàn)榉峙湎禂?shù)不同的緣故。色層分析法③溫度影響溫度能影響物質(zhì)在兩相中的溶解度，同時(shí)也影響紙纖維的光合作用，而使紙的橫截面上固定相的量發(fā)生變化，物質(zhì)的Rf值也隨之變化。在多元溶劑系統(tǒng)中，溫度對溶劑系統(tǒng)的含水量影響十分顯著,成為溫度影響Rf值的主要因素。④pH值影響

溶劑、樣品與濾紙pH值都會影響Rf值與分離后斑點(diǎn)的形狀。改變pH值就改變了分配系數(shù)，從而使Rf值發(fā)生相應(yīng)的改變。⑤展開方式的影響用上升法展開時(shí)，由于地心引力而使濾紙上的流動(dòng)相的量降低，因此Rf值較小。而用下降法展開時(shí)，則使流動(dòng)相的量增加，因此值Rf較大。色層分析法⑥點(diǎn)樣位置高低的影響在展開過程中，濾紙上流動(dòng)相的量上下不一致，距離液面越遠(yuǎn)，流動(dòng)相的量越小，則使點(diǎn)樣位置越高，因此Rf值越小。⑦樣品溶液中雜質(zhì)的影響物質(zhì)在單獨(dú)存在時(shí)測得的Rf值與混合物中同一物質(zhì)的Rf值有時(shí)也會發(fā)生偏差，這主要是由于樣品中雜質(zhì)的干擾。⑧其他影響樣品溶液濃度，展開距離的長短，溶劑蒸汽的飽和程度等對Rf值都有不同程度的影響。

色層分析法2.定量分析

（1）斑點(diǎn)面積定量法

在一濃度范圍內(nèi)，圓形或橢圓形斑點(diǎn)的面積與物質(zhì)含量的對數(shù)成正比，因此，可以用測量斑點(diǎn)面積的方法來定量。

①斑點(diǎn)長度的測量。對于整齊的橢圓形斑點(diǎn)，斑點(diǎn)長度與物質(zhì)的含量成正比。②求積儀測量。③方格計(jì)數(shù)法。將斑點(diǎn)用鉛筆復(fù)寫在小方格上，然后計(jì)算方格的數(shù)目。④稱重法。將斑點(diǎn)剪下稱重。

色層分析法（2）稀釋法取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將各標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紙上層析，顯色后，求出該物質(zhì)能被檢出的最低濃度（界限濃度），取樣品溶液按上述同樣操作，求出最低濃度，根據(jù)在最低濃度時(shí)樣品溶液的稀釋倍數(shù)，即可求得該物質(zhì)的濃度。此法誤差為（10-15）%，只能作半定量用。

色層分析法（3）洗脫法將濾紙上的斑點(diǎn)剪下，用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行洗脫，顯色后，在分光光度計(jì)上比色，測出光密度（如物質(zhì)本身具有紫外光吸收性質(zhì)，可直接將洗脫液在紫外光分光光度計(jì)上測出光密度），另取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述同樣操作，求出各標(biāo)準(zhǔn)溶液的光密度，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品溶液的光密度查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求得該物質(zhì)的含量。（4）直接比色法用特定的分光光度計(jì)直接測量濾紙上斑點(diǎn)顏色的濃度，畫出曲線，由曲線所包含的面積即可求得含量。色層分析法四、應(yīng)用實(shí)例——氨基酸的紙上層析

1．目的2．原理3．器材①層析缸；②毛細(xì)管；③噴霧器；④培養(yǎng)皿；⑤層析濾紙（新華一號）。4．試劑①展開劑是4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物。將20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，加25mL水混合，充分靜置后分層，放出下層水分。取漏斗內(nèi)的展開劑5mL置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒入培養(yǎng)皿中備用。色層分析法

②氨基酸溶液0.5%的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液（各組分濃度均為0.5%）各5mL。

③顯色劑

0.1%水合茚三酮正丁醇：稱取0.1g合茚三酮溶于100mL正丁醇溶液中。

5．操作方法①將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸內(nèi)。②選Whatman1號（快速、薄紙）濾紙一張為層析濾紙，將其按縱向剪裁為長22cm，寬14cm，在濾紙的一端距邊緣2-3cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號。

色層分析法③點(diǎn)樣用毛細(xì)管將各氨基酸樣品分別點(diǎn)在圖6-15（a）的6個(gè)位置上，干后再點(diǎn)一次。每點(diǎn)在濾紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過3mm。

圖6-15氨基酸紙上層析圖

色層分析法④展開用線將濾紙縫成筒狀，濾紙的兩邊不能接觸。將盛有約20cm展開劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端在下，展開劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm）。待溶劑上升15-20cm時(shí)即取出濾紙，用鉛筆描出展開溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)吹干。

⑤顯色用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液,然后置烘箱中烘烤5分鐘（100℃）或用熱風(fēng)吹干即可觀察。6．計(jì)算計(jì)算各種氨基酸的Rf值.色層分析法

7．注意

（1）因手上的汗?jié)n印在層析紙上影響結(jié)果的辨別，在操作過程中應(yīng)戴薄的白手套。

（2）點(diǎn)樣濃度太大，則斑點(diǎn)易拖尾，太稀則不易檢出，對于太濃的試樣應(yīng)予稀釋，太稀的試樣可采用濃縮或多次點(diǎn)樣，但每點(diǎn)一次后必須用冷風(fēng)或溫?zé)岽蹈?，每次的點(diǎn)樣位置要重合，否則會使斑點(diǎn)畸形。

色層分析法第四節(jié)薄層層析

薄層層析是把吸附劑或支持劑均勻地鋪在玻璃板上，成一薄層，把樣品點(diǎn)到薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離鑒定目的。薄層層析具有下列優(yōu)點(diǎn)：①展開時(shí)間短。②層析后得到的斑點(diǎn)小而清晰。③能夠使用多種顯色劑。④點(diǎn)樣量少。薄層層析的缺點(diǎn)是Rf值的重現(xiàn)性比紙上層析差，在某些情況下“邊緣效應(yīng)”較為嚴(yán)重。

色層分析法一、分類1.吸附薄層層析吸附薄層層析的原理同吸附柱層析。根據(jù)吸附劑對各種化合物吸附能力的強(qiáng)弱不同，在吸附劑和展開劑中吸附和解吸的差異，使樣品中各物質(zhì)以不同的速度移動(dòng)，最后達(dá)到分離。吸附薄層層析主要用于脂溶性物質(zhì)的分離，但也能分離水溶性物質(zhì)。2.分配薄層層析分配薄層層析的原理同紙上層析。是以所吸收的水或其他溶劑作為固定相，以適當(dāng)?shù)娜軇┳鳛榱鲃?dòng)相來展開，由于樣品中各物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同，從而得到分離。分配薄層層析適用于水溶性物質(zhì)的分離，對于脂溶性物質(zhì)則可用反相薄層層析進(jìn)行分離。

色層分析法3.離子交換薄層層析離子交換薄層層析的原理同離子交換柱層析。一般用離子交換進(jìn)行維維素來制備薄層板，可用來分離某些親水性強(qiáng)的化合物，如核苷酸。4.其他如用凝膠（如交聯(lián)葡萄聚糖凝膠）作為薄層材料，稱為“凝膠層析”，它能起分子篩的作用，適于分離一些高分子化合物，如蛋白質(zhì)、酶和多糖等。

色層分析法二、操作方法與操作條件的選擇在薄層層析中，吸附劑與支持劑往往不能截然區(qū)分，在某此情況下，同一物質(zhì)即可作為吸附劑，又可作為支持劑。1.吸附劑的選擇用于薄層層析的吸附劑要求不應(yīng)溶于水及有機(jī)溶劑，并具有一定的吸附能力，能使樣品混合物得到良好的分離效果，其顆粒應(yīng)具有一定大小。吸附劑的吸附能力強(qiáng)弱不僅決宇于吸附劑本身，還和下列因素有關(guān)：

①吸附能力（即活性）隨水分增加而降低。②與被測物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

色層分析法2.常用的吸附劑①硅膠：硅膠能吸附脂溶性物質(zhì)，也能吸附水溶性物質(zhì)。由于它是略帶酸性的吸附劑，故適于分離酸性及中性的物質(zhì)。其粒度200-250目。②氧化鋁：氧化鋁的吸附能力比硅膠強(qiáng)，它是略帶堿性的吸附劑，適于分離堿性物質(zhì)或用于硅膠不能分離的中性物質(zhì)。層析用的氧化鋁一般為200-300目，粘合力強(qiáng)，可以制軟板，也可以制硬板。③聚酰胺：其優(yōu)點(diǎn)是具有極大的吸附能力，適于帶羥基化合物的分離。用于薄層的聚酰胺粉末，其顆粒大小為0.1-0.2毫米，即70-140目。色層分析法3.支持劑的選擇用于分配薄層的支持劑應(yīng)該是惰性的，沒有吸附力的，但要能吸留較大量的固定相液體。①纖維素：薄層層析用纖維素是長為2-20微米的短纖維，顆粒為70-140目。它有兩種應(yīng)用型式，即天然纖維與微晶纖維素。其中天然纖維素既可作為吸際劑，又可作為支持劑。而微晶纖維只能作為支持劑，適于分離水溶性的物質(zhì)如糖類、氨基酸、核酸等。②硅藻土：薄層用硅藻土的顆粒大小一般為0.07毫米，它與纖維素一樣，適于分離水溶性的物質(zhì)。

色層分析法4.展開劑（1）選擇原則在吸附層析中，當(dāng)所用吸附劑已定，則對同一化合物的解吸能力與展開劑的極性有關(guān)，極性大則洗脫能力也大，即在薄層上斑點(diǎn)展開距離越遠(yuǎn)，Rf值也越大。薄層層析所用的展開劑主要是低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑，并須加以精制。一般使用2-3種組分的多元溶劑系統(tǒng)。對于薄層所用的展開劑的選擇原則與吸附柱層析一樣，也是根據(jù)溶劑的極性、被測物質(zhì)的極性及吸附劑的活性三方面來考慮（見圖6-16）。色層分析法色層分析法（2）選擇方法①微量圓環(huán)法：將待分析的幾個(gè)樣品，用毛細(xì)管點(diǎn)在薄層上，兩點(diǎn)間距離為2-3厘米，再用毛細(xì)管將待選擇的展開劑滴到點(diǎn)樣處，并進(jìn)行展開，干燥后顯色，觀察樣品經(jīng)展開后呈圓環(huán)狀的情況。取同心圓層次清楚，Rf值在0.5左右的溶劑再進(jìn)行復(fù)試，進(jìn)一步?jīng)Q定展開劑的取舍。

②載玻片法：用普通載玻片（2.5×7.5厘米）涂上吸附劑制成薄層板，把樣品點(diǎn)在薄層上，放在盛有3-5毫升待試展開劑的小玻璃缸中展開5厘米，干燥后顯色，根據(jù)顯色情況來確定展開劑的取舍，此法也適用于分配薄層。③圖解法：用硬紙或透明照相底片，按圖6-17制成一供選擇展開劑的簡便選擇器，根據(jù)被測物質(zhì)的極性，將中間可轉(zhuǎn)動(dòng)的三角形的一個(gè)頂端固定，然后根據(jù)其它兩個(gè)頂端所指部位，決定所選擇的吸附劑的活性與展開劑的極性。

色層分析法色層分析法5.操作方法（1）薄層板的制作

①軟板的制備：軟板的制備是用干法涂布。在一根玻璃棒的兩端分別繞幾圈膠布，圈數(shù)多少視所需薄層厚度而定，一般厚度為0.5-0.75毫米，有時(shí)可達(dá)1-2毫米。然后在玻璃板下放一張大于玻璃板的紙，便于回收吸附劑或支持劑。已經(jīng)活化的吸附劑或支持劑倒在玻璃板上，將玻璃板一端固定，然后用玻璃棒壓在玻璃板上，如圖6-17（1）所示，用力均衡勻速地推進(jìn)，中途切勿停頓，否則薄層厚度不均勻，影響分離效果，然后再除去多余的吸附劑或支持劑即成。另外也可用特制的涂布器涂制，見圖6-17（2）。

色層分析法②硬板的制備：硬板采用濕法涂布。i調(diào)漿：調(diào)制漿料是制板的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，用水量多少與調(diào)漿時(shí)間不僅關(guān)系到漿料的稠性，而且也影響到薄層厚度，一般吸附劑或支持劑與蒸餾水用量之比為1:1到1:2.5為宜。調(diào)漿時(shí)要調(diào)和均勻，不要用力過猛而產(chǎn)生大氣泡，使薄層涂布不均勻而影響分離效果。

另外，在某些特定要求下，為了保持薄層具有恒定的pH值，可以用緩沖溶液代替蒸餾水制板。有時(shí)為了減少顯色手續(xù)，在制板時(shí)加入顯色劑或熒光指示劑，調(diào)制成漿后再制板。

色層分析法ii涂板：浸涂法：將玻璃板在調(diào)好的漿液中浸一下，使?jié){液在板面上形成薄層。噴涂法：用噴霧器將漿液均勻地噴在玻璃板上，使形成薄層。推鋪法：同干法涂板。傾淌法：用一根寬口吸管，取調(diào)好的漿注在玻璃板上，然后將玻璃板前后左右傾斜，使?jié){液淌滿整塊玻璃板，再輕敲玻璃板，使江層較為均勻。另外，也可用特制的涂布器，推動(dòng)涂布器將漿液涂在準(zhǔn)備好的玻璃板上，這種涂布器一次可涂布很多厚度一致的薄層板。

薄層涂好后平放，在溫室下任其自然干燥。

色層分析法③活化：涂好的吸附薄層要進(jìn)行活化?；罨康氖鞘蛊涫ニ?，具有一定的吸附能力。其操作是先將自然干燥后的薄層板放入干燥箱中干燥，一般硅膠薄層板加熱溫度為100-105℃，活化1小時(shí)。氧化鋁薄層板加熱溫度為800-100℃，活化50-50分鐘?；罨瘯r(shí)間的長短應(yīng)視薄層的厚度和所需活性而定。含有鍛石膏的薄層不能超過128℃，否則會再一次脫水而影響活性?；罨玫谋影宸旁谑⒂袩o水氯化鈣或變色硅膠的干燥器中，供一周內(nèi)使用，超過一周應(yīng)再次活化。對于分配薄層則不需活化，一般使其自然干燥12小時(shí)左右即可使用。如用甲酰胺作固定相，則在使用前才在薄層上噴甲酰胺的丙酮溶液，待丙酮發(fā)揮發(fā)后立即應(yīng)用。

色層分析法④活性測定：i硅膠薄層的活性測定：稱取奶油黃、蘇丹江、靛藍(lán)三種色素各40毫克，溶于100毫升苯中，將此混合液點(diǎn)于薄層上，用苯展開，時(shí)間為30-40分鐘，溶劑前沿上升到10厘米時(shí)，三種色素的Rf值應(yīng)別發(fā)別為0.58,00.19,0.08，則活性為合格。另外，也可取對二甲氨基偶氮苯、靛藍(lán)、蘇丹紅各10毫克，分別溶于1毫升氯仿中，點(diǎn)于薄層上，點(diǎn)的直徑為1-2毫米，用正已烷:乙酸乙酯=9:1展開后，對二甲氨基偶氮苯是在溶劑前沿，靛藍(lán)于后，蘇丹紅在最后則為活性合格。

色層分析法ii氧化鋁薄層的活性測定：我取偶氮苯30毫克，對甲氧基偶氮苯、蘇丹黃、蘇丹紅及對氨基偶氮苯各20毫克，分別溶于50毫升重蒸的無水四氯化碳中，各取20微升點(diǎn)于氧化鋁薄層上，用四氯化碳展開，溶劑上升至10厘米，根據(jù)表6-9所列的Rf值測定其活性。氧化鋁活性級別分五級，Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅳ＞Ⅴ），一般以Ⅱ、Ⅲ級為宜。

活性級別Rf值色素ⅡⅢⅣⅤ偶氮苯0.590.740.850.95對甲氧基偶氮苯0.160.490.690.89蘇丹黃0.010.250.570.78蘇丹紅0.000.100.330.56對氧基偶氮苯0.000.030.080.19表6-9氧化鋁活性級別的測定表

色層分析法⑤變性薄層板與反相薄層板的制作及應(yīng)用：通常由于吸附劑pH值的差異而達(dá)不到分離的效果，如硅膠為微酸性的吸附劑，適于酸性和中性物質(zhì)的分離。對于堿性物質(zhì)則在展開時(shí)會留在原點(diǎn)不動(dòng)或造成嚴(yán)重的拖尾。同理，氧化鋁是堿性吸附劑，不適于酸性物質(zhì)的分離。在這些情況下可使用變性薄層。變性薄層是以酸液、堿液或緩沖液代替水來制備具有一定酸堿度的薄層。制備酸性薄層時(shí)，可用0.5N草酸或0.1N硼酸溶液，堿性薄層可用0.5-1.0N氫氧化鈉或氫氧化鈣溶液，緩沖溶液可用0.2M磷酸緩沖溶液。色層分析法另外，在分配薄層層析中，同紙上層析一樣，對于分離脂溶性物質(zhì)時(shí)可采用反相薄層層析。它是以極性溶劑為流動(dòng)相，而以極性弱的溶劑作為固定相。反相薄層是薄層板制好并干燥后，再以硅酮、十一烷、十四烷、液體石蠟、石油餾分（沸點(diǎn)240℃）、煤油（沸點(diǎn)240-250℃）、硅油等浸漬薄層。其操作是將薄層板小心地浸沒在含5-10%上述化合物的乙醚或石油醚溶液中，數(shù)分鐘后，取出干燥，除去溶劑（乙醚可在室溫?fù)]發(fā)除去，石油醚則應(yīng)在120℃加熱25分鐘）即可。色層分析法⑥燒結(jié)薄層板：這是一種經(jīng)一次制備可以多次使用的薄層板，它的制備、使用及洗滌方法如下。取石英玻璃在球磨機(jī)中磨碎，然后用1:1鹽酸洗滌，再用蒸餾水反復(fù)洗至中性，洗滌時(shí)應(yīng)不斷攪拌。靜置，傾去浮在水面上的玻璃細(xì)粉，最后倒去上層水液。將玻璃粉移入搪瓷盤中，以160-180℃烘1小時(shí)，過200-300目篩備用。另取200-300目氧化鋁，以1:2.5的重量比例與上述玻璃粉混合均勻，用無水乙醇調(diào)成漿狀，按通常方法涂板，涂層厚度為0.25-0.30毫米，在空氣中自然干燥。干燥后放在約5毫米厚的硬石棉板上，在高溫爐中加熱至750-780℃，關(guān)閉電路，自然冷卻后取出備用。色層分析法也可用硅膠H按1:2.5的重量比例與玻璃粉制成燒結(jié)板，但加熱溫度不宜超過750℃，否則就會出現(xiàn)薄層龜裂現(xiàn)象，而且薄層的硬度也較差，易受損傷。用普通玻璃粉代替石英玻璃粉得到的燒結(jié)板同樣可以使用，但因其能吸收波長300納米的紫外線，所以在用熒光激發(fā)顯色劑時(shí)靈敏度有所降低。燒結(jié)薄層板的使用方法在點(diǎn)樣與展開等操作方面和一般薄層板完全一樣。但每次使用后必須將原有斑點(diǎn)及顯色劑的沾污洗滌干凈。洗滌的步驟是先用乙醇或其他有機(jī)溶劑浸泡，自來水沖洗干凈后烘干。再用鉻酸洗液浸泡，自來水沖洗并浸泡至殘留黃色褪去，或加入數(shù)滴濃氨水使黃色褪去，最后用蒸餾水充分洗凈，在110℃烘箱中活化1小時(shí)，取出備用。對于某些不易用此法清除的有機(jī)溶劑，可試在450℃高溫下處理之。色層分析法（2）點(diǎn)樣在點(diǎn)樣前，樣品一般都需經(jīng)過預(yù)處理。液體樣品可直接萃取，固體樣品應(yīng)粉碎后萃取，或經(jīng)過離子交換樹脂除雜后點(diǎn)樣。先將薄層板修整一下，因?yàn)橥亢玫谋影逋闹艿暮穸炔灰拙鶆颍绊懻归_效果。所以在點(diǎn)樣前從干燥器中取出的薄層板，將邊緣約5夜米寬的涂層刮去。在薄層板的底端約1.0-1.5厘米輕輕做一標(biāo)記作為點(diǎn)樣處（原點(diǎn)）。將處理好的被測樣品用合適的溶劑溶解（一般用氯仿、乙醇或其他揮發(fā)性好的有機(jī)溶劑，而不宜用水，因水能降低吸附劑的活性），濃度一般控制在0.01-1.0%為宜。點(diǎn)樣可用微量注射器、微量吸管或毛細(xì)管等。色層分析法點(diǎn)樣量應(yīng)視混合物中各物質(zhì)含量而異，一般為幾微克至幾十微克。如過多，則展開后斑點(diǎn)太大且發(fā)生畸形，使分離不清，過少則不顯斑點(diǎn)。在薄層厚度為0.25毫米時(shí)，點(diǎn)樣量不宜超過50微克，點(diǎn)的直徑以0.2-0.3厘米為宜。且于定量或分離提純時(shí)，可沿原線點(diǎn)上樣品成一直線狀，以使點(diǎn)樣量相應(yīng)增多。

必須注意，對于吸附薄層的修整和點(diǎn)樣過程，應(yīng)力求操作迅速，防止薄層吸濕而降低活性。點(diǎn)樣最好在密閉的器皿中進(jìn)行，如在空氣中點(diǎn)樣則越快越好，點(diǎn)樣后可用熱風(fēng)吹一下。

色層分析法點(diǎn)樣的方法有以下兩種：①直接點(diǎn)樣法：將已純化的樣品清液用點(diǎn)樣管直接點(diǎn)于薄層的原點(diǎn)上，點(diǎn)的直徑不應(yīng)超過0.3厘米，以使展開后得到較好的圓點(diǎn)，同時(shí)應(yīng)注意勿戳破薄層，此法最為常用。②濾紙移樣法：此法適宜于較大量的樣品溶液。操作時(shí)將濾紙用皮帶沖打成3毫米直徑的濾紙片，用針灸針戳起，固定在一個(gè)木塞上，將樣品溶液點(diǎn)在懸空的濾紙片上，揮發(fā)干后再繼續(xù)點(diǎn)樣，直到點(diǎn)完一定量的樣品溶液為止。另外，在薄層板的原線上，用直徑為3毫米的平頭玻璃棒（或其他工具）輕輕壓一下，形成一個(gè)直徑為3毫米的圓穴，將點(diǎn)好樣品的濾紙片用鑷子小心地放入圓穴內(nèi)。如欲使紙片在薄層板上粘牢，可在薄層板的圓穴內(nèi)滴入少許可溶性淀粉糊。

色層分析法（3）展開薄層的展開需在密閉的器皿中進(jìn)行，層析缸可用標(biāo)本缸或長方形玻璃缸。如采用單一的溶展開，且所用的玻璃缸體積較小，則溶劑蒸汽易達(dá)飽和，展開時(shí)間也短，故不必像紙上層析那樣預(yù)先用溶劑蒸汽飽和。如用多元溶劑系統(tǒng)來展開時(shí)，其中極性較弱的和沸點(diǎn)較低的溶劑（例如氯仿-甲醇系統(tǒng)中的氯仿）在薄層板的兩邊較易揮發(fā)，因此，它們在薄層兩邊的濃度比在中部的濃度小，也就是說在薄層的兩邊比中部含有更好的極性較大或沸點(diǎn)較高的溶劑，于是位于薄層兩邊的Rf值要比中間的高，即所謂“邊緣效應(yīng)”，見圖6-18所示。為減輕或消除邊緣效應(yīng)，可在層析缸的內(nèi)壁貼了浸濕了展開劑的濾紙，使層析缸內(nèi)溶劑汽的飽和程度增加，見圖6-19。

色層分析法色層分析法薄層層析的展開方式與紙上層析相似，有上升法、下降法與水平法等。其中以上升法最為常用，上升法的裝置見圖6-20。層析缸一般是可密閉的玻璃缸，它的大小以能容納薄層板為宜。缸可以是立式的，也可以是臥式的。在臥式裝置中，缸內(nèi)外各用木塊墊起10-30°角，使展開劑浸入薄層約0.3-0.5厘米，切勿使點(diǎn)樣處浸入展開劑中。對于不加粘合劑的薄層板只可采用近水平展開，板與水平面成10-20°角。采用立式裝置時(shí)，由于空間容答較大，溶劑蒸汽不易飽和，為了防止邊緣效應(yīng)，必須在層析缸內(nèi)壁貼上用展開劑潤濕的濾紙。當(dāng)展開劑上升至一定距離（一般為10-15厘米）時(shí)，取出薄層板，晾干。

色層分析法另外，與紙上層析一樣，當(dāng)樣品混合物分離不清時(shí)，可采取兩次展開、雙向展開與楔形展開等。展開后物質(zhì)的Rf值應(yīng)在0.15-0.8之間，最好能在0.4-0.5左右，否則應(yīng)選用其他合適的溶劑來展開。

色層分析法（4）顯色①紫外線顯示法：同紙上層析法。有時(shí)對于本身不顯熒光的物質(zhì)，可在制板調(diào)漿時(shí)把熒光指標(biāo)劑（如1.5%磷酸鋅）加入到漿料中，展開后直接在紫外線下觀察斑點(diǎn)。②顯色劑顯示法：一般紙上層析所用的顯色劑均可用于薄層層析中，另外還可采用萬能顯色劑。萬能顯色劑多數(shù)具有腐蝕性，需用玻璃噴霧器噴酒。顯色噴霧時(shí)，噴出的霧慶細(xì)而均勻，不應(yīng)有液滴。對于不含粘合劑的薄層板應(yīng)注意勿使用薄層吹散，為此薄層板與噴霧器的距離應(yīng)銷遠(yuǎn)。噴霧腐蝕性顯色劑時(shí)，必須在通風(fēng)柜中進(jìn)行，并用玻璃板作底襯，以免腐蝕其他物品。對于聚酰胺與纖維素薄層板，則不能使用腐蝕性顯示劑，否則薄層會被腐蝕。

色層分析法萬能顯色劑適用于有機(jī)物的檢出但靈敏度較低，常見的有下列幾種：①10-20%硫酸溶液。②碘結(jié)晶：在密閉容器中用碘蒸汽熏或噴以0.5%碘的氯仿溶液，生成暗褐色斑點(diǎn)，特別是對于不飽和的有機(jī)化合物較為靈敏。③硫酸-重鉻酸鈉：重鉻酸鈉3克溶于20毫升水及10毫升濃硫酸中，噴霧于薄層后，紅色的底上呈現(xiàn)綠色的斑點(diǎn)。④硫酸-釩酸溶液：2克釩酸銨加5毫升水成懸濁液，加50毫升50%硫酸溶液，將薄層于110℃加熱10-20分鐘后噴霧。⑤將薄層板加熱至500℃左右，可出現(xiàn)炭化的斑點(diǎn)。纖維素及聚酰胺薄層板不能使用此法。薄層板顯色后，根據(jù)其Rf值即可進(jìn)行定性鑒定，其定量方法與紙上層析基本相同。

色層分析法三、影響薄層層析的因素薄層層析的影響因素基本上與紙上層析相同，另外還有：①吸附劑的粒度：吸附劑粒度的大小對展開速度、分離效果及Rf值均有顯著影響。如顆粒太粗，展開速度太快，分離效果不好。顆粒太細(xì)，展開速度太慢。如顆粒大小不均勻，則不能制成均勻的薄層，而且展開時(shí)溶劑前沿不齊。②吸附劑的活性：吸附劑的活性與含水量的多少有關(guān)，它能影響Rf值與分離效果。如活性太大，則使Rf值降低。當(dāng)被測物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（S）在同一薄層上展開時(shí)：Rs值或＞1，或＜1，越接近于1，則表示重現(xiàn)性越好。

色層分析法四、啤酒中氨基酸的紙上層析1.原理啤酒中氨基酸的分離與鑒定采用雙向紙上層析法，用吲哚醌為顯色劑，其顯色靈敏度比茚三酮稍低，但由于它能與各種不同氨基酸呈現(xiàn)不同顏色，故可根顏色的不同有助于辯認(rèn)氨基酸。2.試劑與儀器⑴5N氨水（試劑6-12）⑵2N鹽酸溶液（試劑6-1）⑶2N氫氧化鈉溶液（試劑6-2）⑷12%氨水（試劑6-13）⑸6N鹽酸溶液（試劑6-14）色層分析法

⑹10%異丙醇溶液（試劑6-15）

⑺強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂⑻酸向展開劑：正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2（試劑6-16）⑼堿向展開劑：正丁醇:12%氨水=13:3（試劑6-17）⑽吲哚醌顯色劑（試劑6-18）⑾吲哚醌底色褪色劑（試劑6-19）⑿0.5%標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液（試劑6-20）⒀毛細(xì)管或微量注射器⒁層析缸，直徑15厘米，高25厘米⒂新華濾紙1號⒃噴霧器

色層分析法3.操作步驟（1）樣品處理稱取5克濕強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂（如732）于燒杯中，加20毫升2N氫氧化鈉溶液，于80℃水浴浸泡并攪拌30分鐘，棄去酸液，再用10毫升2N鹽酸溶液浸泡一次，用蒸餾水洗至中性，此時(shí)樹脂已轉(zhuǎn)變?yōu)镠型。然后加20毫升啤酒，于37℃水浴攪拌1小時(shí)，使啤酒中的氨基酸留在樹脂上，棄去酒液，用少量蒸餾水洗滌二次。加15毫升5N氨水，于37℃水浴中攪拌10分鐘，此時(shí)氨基酸被洗脫，取清洗衣機(jī)。再于樹脂中加10毫升5N氨水洗脫一次，用10毫升蒸餾水洗滌一次，合并洗脫液與洗滌液，于沸水浴上蒸發(fā)至干，加2毫升10%異丙醇溶液溶解殘?jiān)?，即為處理好的樣品溶液?/p>

色層分析法（2）點(diǎn)樣取一張19×23厘米新華濾紙1號，在右下角距兩底邊各2厘米交點(diǎn)處理用毛細(xì)管點(diǎn)上樣品溶液，見圖5-23，點(diǎn)的直徑應(yīng)小于0.5厘米，共點(diǎn)5-8次。另取一張19×23厘米新華濾紙1號，按上法用毛細(xì)管點(diǎn)上各種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液，每種氨基酸各點(diǎn)二次。此濾紙用作標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的雙向?qū)游鰣D譜。

色層分析法（3）展開將點(diǎn)樣后的兩邊濾紙?jiān)谙嗤牟僮鳁l件下，用上升法進(jìn)行雙向展開。①酸向展開：以濾紙19厘米長的一邊為高，用線縫成圓筒形（注意，紙的兩邊不相碰），放在盛有酸向展開劑的層析缸內(nèi)飽和約1小時(shí)，然后將濾紙有樣品的一端放入展開劑中，待溶劑前沿上升至距頂端約0.5厘米處時(shí)取出，吹干至無正丁醇味為止。②堿向展開：將酸向展開后的濾紙?jiān)谌軇┣把氐囊欢饲腥ゼs1厘米，把濾紙轉(zhuǎn)90°，以23厘米長的一邊為高，用線縫成圓筒形，放入盛有堿向展開劑的層析缸中，并以12%氨水作為平衡溶劑，飽和約1小時(shí)，然后將濾紙放入展開劑中展開，待溶劑前沿到達(dá)濾紙頂端約0.5厘米處時(shí)，取出吹干。以同樣條件堿向再展開一次，吹干。

色層分析法（4）顯色將吲哚醌顯色劑噴射整張濾張，吹干至乙酸味不太重時(shí)，放入100℃烘箱中5-10分鐘，取了。將濾紙放入盛有吲哚醌底色褪色劑的搪瓷盤中褪去底色，此時(shí)各種氨基酸呈現(xiàn)不同的顏色。再將濾紙用自來水沖洗，立即用鉛筆將斑點(diǎn)圈出。4.氨基酸的定性鑒定以樣品的層析圖譜與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的層析圖譜相比較，根據(jù)斑點(diǎn)的位置與顏色鑒定啤酒中所含氨基酸的種類。

色層分析法5.討論①吲哚醌顯色劑與氨基酸所生成的顏色和顯色劑的配制方法有關(guān)，因此必須使用同一次配制的顯色劑進(jìn)行顯色。此外，同一氨基酸在不同pH值下所顯的顏色也有差異，因此必須除盡濾紙上的展開劑后才能顯色。②為了確定各種氨基酸在雙向?qū)游鰣D譜上的位置，可以將各種不同氨基酸，按上述同樣的操作條件，分別在酸向展開劑與堿向展開劑中進(jìn)行單向上升法展開，分別求出它們在兩向中的Rf值，然后以所求得的Rf值以及斑點(diǎn)顏色來確定各種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸在雙向圖譜上的位置。色層分析法③本法所用的展開劑對于絲氨酸與甘氨酸，纈氨酸與蛋氨酸不易被完全分開，但可以根據(jù)它們的Rf值與斑點(diǎn)顏色的不同來辯認(rèn)。如果將紙上層析與紙上電泳合并使用（稱電泳層析法），就可以完全分離清楚。④由于各種氨基酸在本實(shí)驗(yàn)所用的堿向展開劑中的Rf值較小，故需展開二次。如用含酚或吡啶的溶劑系統(tǒng)來展開時(shí)只需一次，但酚與吡啶必須經(jīng)蒸餾純化后才能使用，且酚展開時(shí)速度較慢。

色層分析法五、釀造酒中黃曲霉毒素的測定1.原理黃曲霉毒素B1在紫外線（365納米）照射下能產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)在薄層上顯熒光的最低檢出量與標(biāo)準(zhǔn)樣對照，進(jìn)行定性及半定量的測定。2.試劑與儀器⑴乙醚⑵丙酮⑶氯仿⑷苯⑸乙腈⑹乙烷⑺無水硫酸鈉色層分析法⑻硅膠G⑼安替福民（5%氯酸鈉溶液）（試劑6-27）⑽三氯乙酸⑾黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)貯備液（10微克/毫升）（試劑6-28）黃曲霉毒素B1Ⅰ號標(biāo)準(zhǔn)液（0.5微克/毫升）（試劑6-29）黃曲霉毒素B1Ⅱ號標(biāo)準(zhǔn)液（0.2微克/毫升）（試劑6-30）黃曲霉毒素B1Ⅲ號標(biāo)準(zhǔn)液（0.04微克/毫升）（試劑6-31）⑿層析缸（內(nèi)徑25×6×4厘米）⒀微量注射器（10微升，50微升）⒁玻璃板（5×20厘米）⒂薄層涂布器

⒃80-100瓦高壓汞燈（附365納米濾色片）色層分析法3.操作步驟（1）樣品處理吸取酒樣10毫升分洲漏斗中，加入足量的甲醇（根據(jù)樣品的酒度，使醇——甲醇和乙醇與水約為6:4。如樣品中含酒精量為20%，則需加甲醇10毫升）和20毫升氯仿，用力振搖抽提2分鐘。靜置，待分層后，將下層（氯仿層）通過裝有10克無水硫酸鈉的小漏斗流入蒸發(fā)皿中，再用10毫升氯仿重復(fù)抽提，用少量氯仿沖洗無水硫酸鈉，凈氯仿合并于蒸發(fā)皿中，于65℃水浴上揮發(fā)至干。用2.5毫升苯:乙腈=98:2溶劑溶解殘?jiān)?，并用滴管迅速移至帶塞小瓶中備用。色層分析法?）硅膠G薄層板的制備稱取硅膠G20克于小研缽中，加約50毫升水（加水比一般為1:2-2.5，視硅膠G的性能及氣候略有變動(dòng)），用力研磨1-2分鐘，攪成糊狀后立即涂板，厚度約0.3-0.5厘米，然后用手輕輕敲動(dòng)玻璃板，使硅膠分布均勻，放在水平的板上自然干燥數(shù)分鐘。薄層固化后，于100℃干燥箱中烘2小時(shí)進(jìn)行活化，活化后的薄層板平放于帶有支架的干燥器中保存設(shè)備。

色層分析法（3）點(diǎn)樣先將薄層板周圍邊上的硅膠刮整齊，在距離薄層板下端3厘米的原線上用大頭針或鉛筆輕輕點(diǎn)三個(gè)小點(diǎn)，點(diǎn)間距為1厘米左右，在距下端13厘米處做一記號，作為溶劑上升前沿，見圖6-20（1）。用微量注射器將樣品淮分多次加在點(diǎn)上，要求每次都準(zhǔn)確地點(diǎn)在原點(diǎn)上，點(diǎn)的直徑為2-3毫米，點(diǎn)的大小應(yīng)基本相同。右邊點(diǎn)Ⅱ號標(biāo)準(zhǔn)液10毫升，中間點(diǎn)Ⅲ號標(biāo)準(zhǔn)液20微升，第三點(diǎn)點(diǎn)上待測樣品20微升。點(diǎn)樣時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)吹冷風(fēng)加速溶劑揮發(fā)，如吹熱風(fēng)需控制薄層板溫度不超過40℃。

色層分析法（4）展開采用乙醚橫向展開除雜和氯仿:丙酮=9:1縱向展開的方法。將層析缸楓向斜放（后邊用小木頭填起），內(nèi)放一個(gè)玻璃支架，加5-10毫升無水乙醚（在乙醚中放入適量的無水硫酸鈉脫水），將薄層板（樣品點(diǎn)朝上）橫放在層析缸中，使乙醚浸入薄層板的厚度為0.1厘米左右，勿使點(diǎn)子浸入溶劑中，待乙醚前沿剛到頂端時(shí)，檢疫立即取出揮發(fā)干（或用冷風(fēng)吹干），放入另一盛有10毫升氯仿:丙酮=9:1展開劑的層析缺中，進(jìn)行縱向展開，使薄層板浸入溶劑中約1厘米，待溶劑到達(dá)13厘米處，取出揮發(fā)干（或用冷風(fēng)吹干），在紫外線燈下觀察結(jié)果。

色層分析法4.鑒定（1）初步鑒定將薄層板置于紫外線燈下仔細(xì)觀察（用365納米濾色片），根據(jù)第一點(diǎn)Ⅱ號標(biāo)準(zhǔn)樣出現(xiàn)藍(lán)紫色熒光點(diǎn)相應(yīng)位置，檢查第二點(diǎn)Ⅲ號標(biāo)準(zhǔn)樣的熒光點(diǎn)（此點(diǎn)為最低檢出量0.0004微克），然后觀察樣品在相應(yīng)位置上有否藍(lán)紫色點(diǎn)，如無熒光，則樣品中不含黃曲霉毒素B1或含量在5ppb以下。如出現(xiàn)熒光，則需進(jìn)一步確證。色層分析法（2）確證采用滴加三氯乙酸與黃曲霉毒素B1生成衍生物的方法。取兩塊薄層板，第一塊板點(diǎn)上二點(diǎn)，一點(diǎn)為Ⅲ號標(biāo)準(zhǔn)液10微升，另一點(diǎn)為樣品液20微升。第二塊板上也點(diǎn)上二點(diǎn)，一點(diǎn)為Ⅲ號標(biāo)準(zhǔn)液10微升，另一點(diǎn)為樣品液20微升，并在此點(diǎn)上同時(shí)加10微升Ⅲ號標(biāo)準(zhǔn)液，見圖5-37（2）。然后在兩塊板的各點(diǎn)上均加1滴三氯乙酸，所滴之點(diǎn)應(yīng)蓋住第一次的點(diǎn)。反應(yīng)5分鐘，再用熱風(fēng)吹5分鐘，使三氯乙酸揮發(fā)，但應(yīng)控制薄層板溫度不超過40℃，冷卻后，用乙醚機(jī)橫向展開，再用氯仿:丙酮=8:2縱向展開，取置于365納米紫外線下觀察。先檢查第一塊板上樣品液中是否出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)Rf值相應(yīng)的藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，如沒有，則證明樣品中原有的熒光點(diǎn)不是黃曲霉毒素B1。如有相似的熒光點(diǎn)，可再檢查第二塊板上樣品和同時(shí)加Ⅲ號標(biāo)準(zhǔn)液所產(chǎn)生的熒光點(diǎn)是否重合，如樣品液中所產(chǎn)生的熒光點(diǎn)和Ⅲ號標(biāo)準(zhǔn)液熒光點(diǎn)完合重合，則證明樣品中熒光點(diǎn)是黃曲霉毒素B1。

色層分析法（3）半定量測定及計(jì)算確證樣品中有黃曲霉毒素B1以后，可采用稀釋法進(jìn)行定量。根據(jù)熒光強(qiáng)度確定用不同的稀釋倍數(shù)，點(diǎn)于薄層板上，展開后觀察，直至稀釋到樣品液產(chǎn)品的熒光點(diǎn)和最低檢出量Ⅲ號標(biāo)準(zhǔn)液一樣為止。再按點(diǎn)樣量、稀釋倍數(shù)和取樣重量計(jì)算樣品中黃曲霉毒素B1的含量。式中：V——出現(xiàn)最低熒光時(shí)樣品液的點(diǎn)加體積（毫升）；D——樣品液的總稀釋倍數(shù)；W——所取樣品的重量（克）或體積（毫升）。

色層分析法（4）最低檢出量的測定方法吸取黃曲霉毒素B1Ⅱ號標(biāo)準(zhǔn)液0.10、0.15、0.20、0.25、0.30毫升，均用苯:乙腈=98:2溶液稀釋到1毫升，則每毫升各含有0.02、0.03、0.04、0.05、0.06微克的黃曲霉毒素B1，取上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液10微升滴加于薄層板上，展開后，觀察找出最低熒光的標(biāo)準(zhǔn)液濃度。最低檢出量（微克）=0.01（毫升）×標(biāo)準(zhǔn)液濃度（微克/毫升）最低檢出量因不同實(shí)驗(yàn)條件而異，不能用參考數(shù)據(jù)，在正常情況下為0.0004微克。色層分析法稱取不含黃曲霉毒素B1的樣品兩份，一份作空白對照，另一份樣品中加入黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液，加入量按每克樣品含有0.005微克計(jì)算（相當(dāng)于微克/公斤），以下操作按最低檢出量測定法進(jìn)行。根據(jù)顯示最低熒光的實(shí)際總樣量，求得樣品中實(shí)際測定的含量，計(jì)算回收率?；厥章剩?）=一般回收率可達(dá)80%以上。

色層分析法5.討論①在操作過程中如遇乳化現(xiàn)象，影響氯仿分層，可加少量甲醇幫助分層或采取分次放液法。②薄層用的硅膠G是影響檢出靈敏度的關(guān)鍵因素之一，因此使用硅膠G應(yīng)具有一定的要求，并需作預(yù)備試驗(yàn)，即制板后檢查硅膠G質(zhì)量是否合格，具體要求如下：i樣品中黃曲霉毒素能與雜質(zhì)分離，熒光點(diǎn)圓整清楚。ii空白樣品點(diǎn)加黃曲霉毒素B1最低檢出量時(shí)，能分離并能檢出熒光點(diǎn)，在暗處存放十多個(gè)小時(shí)后熒光點(diǎn)不消失。符合上述兩條件的硅膠G即為合格。

色層分析法③紫外線燈的強(qiáng)度與濾色片的波長必須選擇合格，否則會影響靈敏度。在暗室觀察薄層板的底色較在燈光下顯暗紫色為宜，否則底板有光就不易顯示微弱的藍(lán)紫色熒光點(diǎn)。④黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液有一定的貯存期，應(yīng)予注意，否則測得的結(jié)果不準(zhǔn)確。⑤展開劑中丙酮與氯仿的比例可以根據(jù)Rf值的大小與分離情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，若Rf值小，則可減少氯仿的量，反則增加氯仿的量。⑥凡吸取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)，嚴(yán)禁用口吸。

色層分析法6．附注①消毒劑的使用：由于黃曲霉毒素極毒，因此實(shí)驗(yàn)臺的一切用具必須浸于安替福民溶液（5%次氯酸鈉溶液）中消毒，以破壞殘留的黃曲霉毒素。②使用的溶劑與脫脂棉等必須作熒光檢查：將脫脂棉在索氏提取器中用氯仿抽提2小時(shí)，揮發(fā)干后待用。將瓶內(nèi)濃縮液點(diǎn)于薄層板上，在紫外線下就不顯熒光，則此脫脂棉可不用抽提直接使用。對于氯仿可取5毫升，放入蒸發(fā)皿中，揮發(fā)至干，再加入0.5毫升氯仿充分混合，取20微升點(diǎn)于薄層板上，在紫外線下檢查熒光，如顯熒光，則用展開劑開，決定是否需要重蒸。其他有機(jī)溶劑可直接取20微升點(diǎn)于薄層板上進(jìn)行熒光檢查。

色層分析法第五節(jié)凝膠層析一、基本原理及特點(diǎn)凝膠層析設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，由于所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，因此對分離成分理化性質(zhì)的保持，特別是不改變樣品生物學(xué)活性有獨(dú)到之處。圖6-23凝膠層析分離原理示意圖

色層分析法凝膠層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進(jìn)行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動(dòng)速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之間的分子在流動(dòng)中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時(shí)間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。色層分析法二、

凝膠的種類和性質(zhì)1.葡聚糖凝膠（Sephadex）葡聚糖凝膠是指由天然高分子葡聚糖與其它交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。

葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex系列，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。Sephacryl是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成，是一種比較新型的葡聚糖凝膠。它的分離范圍大，排阻極限甚至可以達(dá)到108，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Sephadex的范圍。所以不僅可以用于分離一般蛋白，也可以用于分離蛋白多糖、質(zhì)粒、甚至較大的病毒顆粒。

Sephacryl的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性比Sephadex高，可以實(shí)現(xiàn)相對比較快速而且較高分辨率的分離。

色層分析法2.瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠是由D－半乳糖和3,6－脫水半乳糖為殘基組成的線性多聚體。其商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，常見的主要有瑞典生產(chǎn)的Sepharose和美國生產(chǎn)的Bio-gel

A等。瓊脂糖凝膠在pH為4～9之間穩(wěn)定的，機(jī)械強(qiáng)度和孔穴的穩(wěn)定性都好，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會發(fā)生明顯變化，使用瓊脂糖凝膠時(shí)洗脫速度可以比較快。瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。瓊脂糖凝膠不耐高溫，40℃以上開始融化，使用溫度以0～30℃為宜。

色層分析法3.聚丙烯酰胺凝膠：

聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯(lián)度的產(chǎn)物。聚丙烯酰胺凝膠主要由Bio-Rad

Laboratories生產(chǎn)，商品名為Bio-Gel

P，主要型號有Bio-Gel

P-2;

Bio-Gel

P-300等，P后面的數(shù)字乘以1000即相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍、吸水率等性能與Sephadex相近。聚丙烯酰胺凝膠在水溶液、一般的有機(jī)溶液、鹽溶液中都比較穩(wěn)定。聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩(wěn)定性較好，在pH為1~10之間比較穩(wěn)定。但在較強(qiáng)的堿性條件下或較高的溫度下，聚丙烯酰