單抗制備過程

動物的選擇與免疫1.動物的選擇：純種BALB/C小鼠2.免疫方案：根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先制備免疫原，再加佐劑。初次免疫抗原1?50pg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內(nèi)注射（一般0.8?1ml,0.2ml/點）I3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）I3周后第三次免疫劑量同一，不加佐劑，ip（5?7天后采血測其效價）I2?3周加強免疫，劑量50?500pg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）I3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，增強免疫細胞對抗原的反應性。細胞融合（1）主要試劑的配制a、細胞培養(yǎng)基雜交瘤技術中使用的細胞培養(yǎng)基主要有RPMI-1640或DMEM（DulbercoModifiedEaglesMedium）兩種基礎培養(yǎng)基，具體配制方法按廠家規(guī)定的程序，配好后過濾除菌（0.22um）,分裝，4°C保存。b、氨基喋吟（A）貯存液（100x，4x10-5mol/L）:稱取1.76mg氨基喋吟（AminopterinMW440.4），溶于90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20C保存。c、次黃嘌吟和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液（100x,H:10-2mol/L,T:1.6x10-3mol/L）:稱取136.1mg次黃嘌吟（Hypoxanthine,MW136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine,MW242.2），加超純水或四蒸水至100ml，置45-50C水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20C凍存。用前可置37C加溫助溶。d、L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100x，0.2mol/L）:稱取2.92gL-谷氨酰胺（L-glutamine，MW146.15），用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20C凍存。e、青、鏈霉素（雙抗）溶液（100x）:取青霉素G（鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g,溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20C凍存。仁7.5%NaHCO3溶液：稱取分析純NaHCO37.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4C保存。g、HEPES溶液（1mol/L）:稱取23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N,-2-ethanesulfonicacid,N-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW238.3）溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶）,4C保存。h、8-氮鳥嘌吟貯存液（100x）:稱取200mg8-氮鳥嘌吟（8-azaguanine，MW152.1），加入4mol/LNaOH1ml，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml,過濾除菌；分裝小瓶，-20C凍存。使用時按1%濃度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml）。i、50%PEG:稱取PEG1000或400020-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80C水浴融化，0.6ml分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20C存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許7.5%NaHCO3調(diào)PH至8.0,或購買Sigma或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn)品。⑵髓瘤細胞的準備目標是使細胞處于對數(shù)生長的時間盡可能長。凍存的細胞在復蘇后要2周時間才能處于適合于融合的狀態(tài)。在實驗室中處于對數(shù)生長的骨髓瘤細胞維持在含10%小牛血清的培養(yǎng)基中，方法是用6個裝5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細胞。1周后到細胞相當密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下：a、于融合前48-36小時，將骨髓細胞擴大培養(yǎng)（一般按一塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細胞進行準備）。b、融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁瘤輕輕吹下，收集于50ml離心管或融合管內(nèi)。c、1000r/min離心5-10分鐘，棄去上清。d、加入30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細胞重懸浮于10ml不完全培養(yǎng)基，混勻。e、取骨髓瘤細胞懸液，加0.4%臺盼藍染液作活細胞計數(shù)后備用。細胞計數(shù)時，取細胞懸液0.1ml加入0.9ml臺盼藍染液中，混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)。計算細胞數(shù)目的公式為：每毫升細胞數(shù)=4個大方格細胞數(shù)x105/4；或每毫升細胞數(shù)=5個中方格細胞數(shù)x106/2⑶脾淋巴細胞的準備取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，于解剖臺板上固定后掀開左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，輕輕洗滌，并細心剝?nèi)ブ車Y締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟），使脾細胞進入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數(shù)次，制成單細胞懸液。為了除去脾細胞懸液中的大團塊，可用200目銅網(wǎng)過濾。收獲脾細胞懸液，1000r/min離心5-10分鐘，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，然后將細胞重懸于10ml不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液，加臺酚藍染液作活細胞計數(shù)后備用。通常每只小鼠可得1x108-2.5x108個脾細胞，每只大鼠脾臟可得5x108-10x108脾細胞。⑷飼養(yǎng)細胞（Feedercells）的制備在細胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養(yǎng)細胞。一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。常用的飼養(yǎng)細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下：按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5mlHAT培養(yǎng)基將沉淀細胞懸浮，根據(jù)細胞計數(shù)結果，補加HAT培養(yǎng)基，使細胞濃度為2x105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，96孔培養(yǎng)板每孔需2x104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每只小鼠可得3-5x106個細胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板的飼養(yǎng)細胞。也可在細胞融合前1-2天制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞，這樣使培養(yǎng)板孔底先鋪上一層飼養(yǎng)細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當于2滴），然后置37r6%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑸細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)A、將1x108脾細胞與2x107-5x107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，補加不完全培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。B、1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。C、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細胞松散均勻;置40°C水浴中預熱。D、用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時間為45秒）加預熱至40C的50%PEG（PH8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。E、用10ml吸管在90秒內(nèi)加20-30ml預熱至37C的不完全培養(yǎng)基；20-37C靜置10分鐘。F、1000r/min5分鐘；棄去上清。G、加入5mlHAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養(yǎng)基至80-100ml。H、分裝96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后將培養(yǎng)板置37C，6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。I、5天后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。J、7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。L、經(jīng)常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測?？扇苄钥乖拿嘎?lián)免疫吸附試驗（ELISA）純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。以50-100ul/孔量加入酶標板孔中，置4C過夜或37C吸附2小時。棄去孔內(nèi)的液體，同時用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，拍干。每孔加200ul封閉液4C過夜或37C封閉2小時；該步驟對于一些抗原，可省略。洗滌液洗3次；此時包被板可-20°C或4°C保存?zhèn)溆谩Ｃ靠准?0-100ul待檢雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，同時設立陽性、陰性對照和空白對照；37C孵育1-2小時；洗滌，拍干。加酶標第二抗體，每孔50-100ul,37C孵育1-2小時，洗滌，拍干。加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul,37C10-30分鐘。以2mol/LH2SO4終止反應，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。結果判定：以P/NZ2.1,或PZN+3D為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結果。雜交瘤細胞的克隆化（1）有限稀釋法材料：a.96孔細胞培養(yǎng)板等；b.HT培養(yǎng)基；c.活力強的雜交瘤細胞；d.小鼠腹腔細胞。方法：制備小鼠腹腔細胞。同“細胞融合”一節(jié)中的方法。制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細胞3中不同的稀釋度。按每毫升加入5x104-1x105細胞的比例，在上述雜交瘤細胞懸液中分別加入腹腔巨噬細胞。每種雜交瘤細胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細胞數(shù)分別為0.5、3和10。37C、7.5%CO2濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養(yǎng)，并凍存。本法中（b）、（c）、（d）也可簡化為將計數(shù)后的雜交瘤細胞準確地進行系列稀釋，直至每毫升含10個細胞，按每孔接種0.1ml細胞懸液，即每孔含1個細胞。雜交瘤細胞的凍存與復蘇（1）雜交瘤細胞的凍存A、材料：帶蓋吸管筒一只（鋁質(zhì)或洋鐵皮制），內(nèi)壁（包括筒底和蓋）襯1-2層石棉紙或石棉布。b.含10-20%血清、5-10%DMSO的HT培養(yǎng)基，冰浴降溫至0C左右（用作凍存液）。c.滅菌安瓶或帶蓋小瓶。d.-70C冰箱。e.液氮及液氮罐。f.處于對數(shù)生長中期、健康而活力好的雜交瘤細胞。B、方法：將雜交瘤細胞（或其他細胞）離心，重新懸浮于預冷的凍存液中，濃度為106-107左右/ml,分裝安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上標明細胞名稱、凍存日期、批號等。安瓶封口后仍置冰浴上。將安瓶放入一帶收口繩的小布袋內(nèi)，布袋上標明凍存號、細胞名稱等，立即將布袋放入吸管筒內(nèi)，置-70C冰箱。2-4小時后或過夜后從-70C冰箱取出吸管筒，將盛有細胞的布袋移入液氮罐；在布袋的線繩上作好標記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細記錄。液氮罐應定期補充液氮；補充液氮及存取細胞時應帶保護眼鏡和手套，以免因液氮凍傷等。（2）雜交瘤細胞的復蘇復蘇時，從液氮中取出安瓶，立即在37C水浴融化，待最后一點冰塊快要融化時，從水浴中取出，置冰浴上。用5-10mlHT培養(yǎng)基稀釋，1000r/min10分鐘，棄上清，再懸浮于適量HT培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶或24孔板，置37C，7.5%CO2培養(yǎng)。如果細胞存活力不高，死細胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔細胞進行培養(yǎng)。單抗特性的鑒定⑴單克隆性的確定A、雜交瘤細胞的染色體分析對雜交瘤細胞進行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細胞的客觀指標之一，雜交瘤細胞的染色體數(shù)目應接近兩種親本細胞染色體數(shù)目的總和，正常小鼠脾細胞的染色體數(shù)目為40,小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為62-68,NS-1為54-64；同時骨髓瘤細胞的染色體結構上反映兩種親本細胞的特點，除多數(shù)為端著絲點染色體外，還出現(xiàn)少數(shù)標志染色體。一般來說，雜交瘤細胞染色體數(shù)目較多且較集中，其分泌能力則高，反之，其分泌單抗能力則低。檢查雜交瘤細胞染色體的方法最常用秋水仙素法，其原理是應用秋水仙素特異的破壞紡錘絲而獲得中期分裂相細胞；再用0.075mol/LKCl溶液等低滲處理，使細胞膨脹，體積增大，染色體松散；經(jīng)甲醇-冰醋酸溶液固定，即可觀察檢查。其操作步驟如下：a.在加秋水仙素前48-36小時將雜交瘤細胞傳代。秋水仙素處理：在培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20°C保存），使最終濃度為0.1-0.4ug/ml（若改用秋水仙胺則最終濃度為0.02-0.05ug/ml）；繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時，然后吹打細胞，移入離心管中，1000r/min10分鐘，棄上清。加入已預溫到37C的0.075mol/LKCl溶液5ml，將沉淀細胞懸浮并混勻，37C水浴15-20分鐘。向懸液中加入新配制的固定液（甲醇與冰醋酸3：1混合）1ml,混勻，然后1000r/min10分鐘，棄去上清液；本步驟的目的是使細胞表面輕微固定，可防止固定后細胞粘連成團塊。加入固定液5ml，將細胞懸浮并混勻，室溫靜置20-30分鐘，然后1000r/min10分鐘，棄去上清液；重復操作一次;其后加5ml固定液，將細胞懸浮并混勻，封上管口，置4C過夜。取出離心管，1000r/min5分鐘，輕輕吸去上清液，根據(jù)細胞壓積多少而留下0.5-1ml固定液，將細胞懸浮并混勻后，吸取細胞懸液1-2滴，滴在剛從冰水中取出的載玻片上，用口吹散，并在火焰上通過數(shù)次，使細胞平鋪于載玻片上，自然干燥。用新配制的10%Giemsa染液染色10-20分鐘，然后用自來水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g,甘油33ml，55-60C保溫2小時，加甲醇33ml混勻，保存于棕色瓶內(nèi)作為原液；取原液1份,加1/15mol/LPH6.8PBS9份，即成10%Giemsa染液）。鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細胞進行觀察分析。每份標本應計數(shù)100個完整的中期核細胞，并注意觀察是否有標志染色體。B、抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定最經(jīng)常得到的單抗是IgM和IgG，分泌IgE的雜交瘤細胞很少見，而分泌IgA的雜交瘤通常只有在用于融合的淋巴細胞來自腸道相關淋巴組織才能得到。如在抗體檢測中使用葡萄球菌A蛋白試劑，則不可能得到IgG以外的其他類的抗體。鑒定單抗Ig類和亞類的方法主要有兩種，一種是免疫擴散，另一種是ELISA。（B）ELISA法該法不需要將樣品濃縮，而且比免疫擴散法更快地得到結果。材料：a.ELISA所需用溶液同雜交瘤細胞的篩選一節(jié)。b.酶標板。c.山羊抗鼠Ig；兔抗小鼠Ig類及亞類特異性血清；HRP結合的山羊抗兔Ig等。d.待檢雜交瘤細胞培養(yǎng)上清；陰性、陽性對照樣品。方法一：每孔加入適量的100ul山羊抗小鼠Ig,室溫2小時；洗滌液洗2次。每孔加200ul封閉液，室溫作用1小時。洗滌液洗2次；加100ul雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，4C過夜；設陰性、陽性對照孔。洗滌4次，每孔加100ul兔抗小鼠Ig類及亞類特異性抗血清，室溫2小時。洗滌4次，加100ulHRP標記的山羊抗兔Ig；室溫作用2小時。洗滌后，加底物顯色，判讀結果。若有HRP標記的抗小鼠Ig類及亞類試劑，則可省去e。方法二：以適宜濃度的抗原包被酶標板，100ul/孔，4C過夜。洗滌后，加入待檢的單抗樣品，100ul/孔，37C1小時；設陰性、陽性對照孔。洗滌后，加入HRP標記的抗小鼠類及亞類Ig的抗體試劑，100ul/孔，37C避光顯色15分鐘；用2mol/LH2SO4終止反應后，閱讀各孔的OD490值。C、單抗純度的鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS、等電點聚焦電泳（IEF）及免疫轉(zhuǎn)印分析（WB）等方法⑵單抗理化特性的鑒定單抗對溫度和PH變化的敏感性以及單抗的親合力都是理化特性鑒定的主要項目抗體親合力是指抗體與抗原或半抗原結合的強度，其高低主要是由抗體和抗原分子的大小、抗體分子結合簇（部）和抗原決定簇之間的立體構型的合適程度決定的。親合力通常以平均內(nèi)在結合常數(shù)（K）表示。單抗親合力測定可為正確選擇不同用途的單抗提供依據(jù)。在建立各種檢測方法時，應選用高親合力的單抗，以提高敏感性和特異性，并可節(jié)省試劑。而在親和層析時，應選用親合力適中的單抗作為免疫吸附劑，因為親合力過低不易吸附，親合力過高不易洗脫。競爭性ELISA測定單抗親和常數(shù)的方法。其步驟是：取適宜濃度的純化抗原包被酶標板，100ul/孔，4°C過夜。洗滌后，加入封閉液（0.5%BSA-PBS,PH7.2）100ul/孔，37°C1小時。取一定濃度的單抗，與系列倍比稀釋的抗原混合，4C過夜，使反應達到平衡；必須注意所用抗原濃度至少要比抗體濃度高10倍以上。將平衡后的抗原抗體復合物加入酶標板孔中，100ul/孔，37C1小時。洗滌后，加入適宜稀釋度的HRP標記抗小鼠IgG抗體，100ul/孔，37C1小時。洗滌后，加入底物（OPD）溶液，100ul/孔，37C顯色15分鐘；2mol/LH2SO4終止反應后，于495nm波長測定各孔的吸收率（A）。按下列公式計算各單抗的親和常數(shù)（K）：A0/（A0-A）=1+K/a0其中A0=無抗原時A值；人=采用不同濃度抗原時的A值；a0=抗原總量；K=親和常數(shù)。⑶單抗與相應抗原的反應性測定單抗與相應抗原的反應性決定于它所識別的抗原表位，確定單抗針對的表位在抗原結構上的位置，是單抗特性鑒定的關鍵環(huán)節(jié)，同時，進一步分析這類表位的差別，可正確評價單抗的特異性和交叉反應性，如一些抗原為同屬不同血清型共有，甚至是科內(nèi)不同屬所共有，而另一些抗原表位則是某種血清型乃至某一菌株或毒株所特有。此外，單抗的反應性往往呈現(xiàn)一種或幾種免疫試驗特異性，這在建株時予以測定，有利于正確使用這些單抗。單抗反應性測定的方法很多，包括各類免疫血清學試驗、生物學試驗和免疫化學技術等，選擇何種方法依據(jù)不同的單抗特性和試驗目的而定。單克隆抗體的生產(chǎn)1、單抗的大規(guī)模制備（1）動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法迄今為止，通常情況下均采用動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法，使用的動物首選BALB/c小鼠。本方法即將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高?？梢娫摲ú僮骱啽恪⒔?jīng)濟，不過，腹水中常混有小鼠的各種雜蛋白（包括Ig），因此在很多情況下要提純后才能使用，而且還有污染動物病毒的危險，故而最好用SPF級小鼠。A、材料：a.成年BALB/c小鼠。b.降植烷（Pristane）或液體石蠟。c.處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞。B、方法：腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠0.3-0.5ml。7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞，每只小鼠5x105心2ml。間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用16號針頭采集腹水，一般可連續(xù)采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水；將腹水離心（2000r/min5分鐘），除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，70C凍存?zhèn)溆?，或凍干保存。?）體外培養(yǎng)生產(chǎn)單抗的方法總體上講，雜交瘤細胞系并不是嚴格的貼壁依賴細胞（anchoragedependentcell，ADC），因此既可以進行單層細胞培養(yǎng)，又可以進行懸浮培養(yǎng)。雜交瘤細胞的單層細胞培養(yǎng)法是各個實驗室最常用的手段，即將雜交瘤細胞加入培養(yǎng)瓶中，以含10-15%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞濃度以1x106-2x106/ml為佳，然后收集培養(yǎng)上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。顯然，這種方法制備的單抗量極為有限，無疑是不適用于單抗的大規(guī)模生產(chǎn)。要想在體外大量制備單抗，就必須進行雜交瘤細胞的大量（高密度）培養(yǎng)。單位體積內(nèi)細胞數(shù)量越多，細胞存活時間越長，單抗的濃度就越高，產(chǎn)量就越大。目前在雜交瘤細胞的大量培養(yǎng)中，主要有兩種類型的培養(yǎng)系統(tǒng)。其一是懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐式的生物反應器，其中包括使用微載體；其二是細胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，包括中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微囊化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。（3）雜交瘤細胞的無血清培養(yǎng)雜交瘤細胞的體外培養(yǎng)絕大多數(shù)應用DMEM或RPMI-1640為基礎培養(yǎng)基，添加10-20%胎?；蛐律∨Ｑ濉；A培養(yǎng)基主要提供各種氨基酸、維生素、葡萄糖、無機鹽、各種合成核酸和脂質(zhì)的前體物質(zhì)。而血清主要供給雜交瘤細胞等各種營養(yǎng)成分，血清中的激素可刺激細胞生長，其中的許多蛋白質(zhì)能結合有毒性的離子和熱源質(zhì)而起解毒作用，同時這些蛋白質(zhì)對激素、維生素和脂類有穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用。2、單抗的純化（1）腹水型單抗的純化在單抗純化之前，一般均需對腹水進行預處理，目的是為了進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質(zhì)、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者處理效果為佳，而且操作簡便。A■二氧化硅吸附法：新鮮采集的腹水（或凍存的腹水），2000r/min15分鐘，除去細胞成分（或凍存過程中形成的固體物質(zhì)）等；取上層清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥緩沖鹽水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCI,0.8mmol/LMg2+,0.3mmoI/LCa2+）稀釋；然后以每10ml稀釋腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時搖動；2000g離心20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清的腹水。（2）單抗的粗提A、硫酸銨沉淀法飽和硫酸銨溶液的配制：500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/LNaOH調(diào)PH至7.8。鹽析：吸取10ml處理好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5.0ml；繼續(xù)緩慢攪拌30分鐘；10000r/min離心15分鐘；棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鐘，同法離心；重復前一步1-2次；沉淀物溶于1.5mlPBS（0.01mol/LPH7.2）或Tris-HCl緩沖液中。脫鹽：常用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過SephadexG-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鐘1ml。第一個蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2%NaHCO3,1mmol/LEDTA溶液中煮10分鐘，用蒸餾水清洗透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮