造血系統(tǒng)惡性疾病合并造血常見的造血意義

造血系統(tǒng)惡性疾病合并造血常見的造血意義

針對血液系統(tǒng)疾病的惡性疾病、惡性淋巴結(jié)和再生障礙缺血性紅細胞的患者，以及由化療和放療引起的中性細胞缺如和吞咽細胞功能障礙的藥物使用的大量廣?？股兀瑢е录賳伟『碗p重感染的病例逐年增多。敗血癥是血液病特別是惡性血液病常見的醫(yī)院感染。敗血癥是一類因多種病原菌進入機體血液系統(tǒng)后迅速繁殖、產(chǎn)生大量毒素,激發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的過度炎癥性反應,致死率極高。如何深入認識敗血癥的發(fā)病機制,并尋求相應的干預策略是敗血癥研究的重點及難點。敗血癥發(fā)病機理的研究主要得益于多種動物模型的建立。動物模型的建立一方面要有良好的穩(wěn)定性、可重復性,最重要的是要能很好地模擬臨床敗血癥的病理過程。在眾多敗血癥動物模型中,盲腸結(jié)扎穿孔模型(ceacalligationandpuncture,CLP)應用較多,但目前尚缺乏規(guī)范、統(tǒng)一的操作步驟及評價標準。為了更好地將這一模型用于敗血癥防治研究,我們在多次重復實驗的基礎(chǔ)上,探索了一種成熟、穩(wěn)定的敗血癥模型制備方法。同時為了驗證我們制備的模型與臨床敗血癥的一致性,我們還從動物整體死亡率,體重變化,炎性因子C5a、IL-6、TNF-α、IFN-γ等變化,胸腺淋巴細胞及腸系膜淋巴細胞凋亡情況,胸腺及脾組織病理變化等不同方面對我們的動物模型進行了評價。材料和方法6-8周齡雄性C57小鼠購于本院實驗動物中心,于本院普通級動物房飼養(yǎng)。檢測試劑和檢測方法淋巴細胞凋亡檢測試劑盒購于北京精美生物技術(shù)公司。C5aELISA檢測試劑盒購于PharMingen公司。IL-6、TNF-α、IFN-γELISA檢測試劑盒購于eBioscience公司。PE標記抗小鼠CD4+抗體購于eBioscience公司。速眠新及氯氨酮購于福建吉田制藥有限公司?？鼓齽?ACD)購于Baxter.Deerfield公司。手術(shù)刀片、剪刀、8號注射器針頭購于北京京鹿手術(shù)器械有限公司,縫合線、縫合針、結(jié)扎線購于上海醫(yī)用縫合針廠有限公司。麻醉溫度的確定將氯氨酮、速眠新、生理鹽水按2∶1.5∶3.5體積比,混合均勻后于4℃條件下冷藏,C57小鼠麻醉劑量為0.05毫升/只,選用腹腔注射法進行麻醉。盲腸遠端部位聯(lián)合穿刺C57小鼠麻醉后仰臥于手術(shù)臺上固定,75%酒精消毒腹部,劍突下一指沿腹白線用手術(shù)刀打開約2-3cm切口。暴露腹部、找到盲腸部位,以3-0號絲線結(jié)扎盲腸遠端部位,結(jié)扎2/3寬度,并用8號針頭穿刺腸壁2次,擠出適量腸內(nèi)容物,將腸內(nèi)容物及盲腸按原位放回腹腔,逐層關(guān)腹,分別縫合結(jié)扎。假手術(shù)組同樣需暴露腸內(nèi)容物,但不進行腸結(jié)扎及穿孔操作?？鼓幚硎中g(shù)后不同時間點將C57小鼠進行眼球放血,分別收集血清及血漿,血漿ACD進行抗凝處理,血液與ACD比為9∶1。樣品收集后室溫條件下5000rpm離心10分鐘,吸取上層血清及血漿,于-80℃保存?zhèn)溆?。fcs/pbs包的制備C5a、IFN-γ、IL-6和TNF-α的檢測依據(jù)細胞因子檢測試劑盒說明書。一抗(1-5μg/ml)溶解于包被液(碳酸鹽緩沖液pH9.6),100μl/well包被ELISA親和96孔板,4℃放置過夜后,10%FCS/PBS封閉2小時。用PBS-T洗板3次,加入100μl/well樣品(1∶10-1∶100稀釋),室溫放置1小時,用PBS-T洗板3次,加入Biotin化抗體(1-5μg/ml),室溫放置1小時,用PBS-T洗5次,加入Avidin-HRP(1∶1000稀釋,100μl/well)室溫放置半小時,以OPD或TMB顯色系統(tǒng)顯色,測OD492或OD450值,根據(jù)標準曲線確定細胞因子水平。facs液制備手術(shù)18-20小時后動物進入炎癥反應的急性期。C57小鼠眼球放血后脫臼處死,分離胸腺組織及腸系膜淋巴結(jié),組織研磨后濾網(wǎng)過濾去除組織碎片,細胞用FACS液洗2次備用。首先標記PE標記的CD4+抗體,隨后按凋亡檢測試劑盒說明書標記FITC標記的AnnexinⅤ抗體,細胞染色完成后立即用FACSCalibur流式細胞儀進行分析。胸腺及脾組織病理學檢測CLP術(shù)后20-24小時用頸椎脫臼法或眼球放血法將C57小鼠處死,鈍性分離胸腺組織及脾組織,組織分塊切割后置于10%福爾馬林液中固定,經(jīng)脫水包埋處理后,制作石蠟切片,切片厚3-5um,HE染色,在光學顯微鏡下觀察胸腺及脾組織病變情況。動物生存率的相關(guān)性成組設計資料均數(shù)或有一個重復變量的兩因素設計的T檢驗,Kaplan-Meier統(tǒng)計分析方法比較兩組動物的生存率,p﹤0.05被認為有顯著性差異。結(jié)果對于動物的臟器黏連情況,一般認為是說外觀上的動物,只是細胞更新檢測結(jié)果顯示,隨著急性炎癥的進一步惡化,70%-80%的動物于術(shù)后72小時內(nèi)死亡,在限定的觀察時間內(nèi)只有20%左右動物生存(圖1A),而存活下來的動物消化系統(tǒng)臟器黏連嚴重,腹腔會形成較大范圍囊腫。因囊腫形成及消化系統(tǒng)功能受損,動物體重減輕,CLP手術(shù)組與對照組動物體重比較降低明顯(圖1B,p<0.05)。炎癥介質(zhì)及介質(zhì)C5a,IL-6,TNF-α,IFN-γ是與敗血癥相關(guān)的重要炎癥介質(zhì)。用ELISA法對CLP手術(shù)后不同時間點檢測結(jié)果表明,補體C5a(圖2A)、IL-6(圖2B)、TNF-α(圖2C)、IFN-γ(圖2D)等在CLP手術(shù)后表達均為顯著的上調(diào)。cd4+淋巴細胞凋亡率檢測CLP術(shù)后20小時分離小鼠的胸腺和腸系膜并用流式細胞術(shù)方法檢測CD4+淋巴細胞的凋亡率。結(jié)果顯示,CLP組小鼠與對照組小鼠相比,胸腺(圖3A)及腸系膜(圖3B)的CD4+淋巴細胞均出現(xiàn)了明顯凋亡。紅染、脾組織檢測我們于手術(shù)的急性期后(20小時)分別取胸腺組織及脾組織進行HE染色觀察。結(jié)果顯示,胸腺皮質(zhì)下充滿大量細胞碎片,細胞核出現(xiàn)紅染(圖4A)。脾組織表現(xiàn)組織腫大,被膜外有大量纖維及炎性細胞滲出;滲出細胞以中性粒細胞為主,核為分葉核;紅髓范圍擴大內(nèi)含粒細胞及淋巴細胞,脾竇充滿大量紅細胞(圖4B)。從臨床轉(zhuǎn)染的角度表達模型造血系統(tǒng)惡性疾病患者由于其疾病特點及化療藥物的應用,機體免疫功能低下,粒細胞減少甚至缺乏,極易受病原微生物的侵襲致醫(yī)院感染性敗血癥,使得近年來敗血癥的發(fā)生逐年增多,敗血癥早期診斷困難,死亡率居高不下,嚴重影響了血液系統(tǒng)疾病的治療效果。為此我們成功建立了敗血癥的小鼠模型,為醫(yī)院感染性敗血癥的研究提供了良好的實驗平臺。敗血癥是一類由局部感染病原菌而最終導致機體發(fā)生全身系統(tǒng)性反應的炎癥性疾病,主要表現(xiàn)為:高水平炎性細胞因子產(chǎn)生,淋巴細胞大量凋亡,多種臟器(脾臟、心臟、肺臟、肝臟、心臟)出現(xiàn)病理性破壞。目前臨床研究中針對敗血癥的各種治療尚未取得良好療效,主要原因是發(fā)病機理不清楚,病原菌大量入侵導致免疫防御功能受損,而防御功能受損進一步加重機體的感染損傷,多種因素互為因果導致最終全身臟器功能衰竭。為了能找到各類炎性細胞因子及參與炎性反應的各種細胞之間的調(diào)控關(guān)系,首先需要我們建立一種簡單、可靠的動物模型。人們對敗血癥的研究主要得益于多種動物模型的建立,主要包括3類:①直接注射外源毒素例如LPS、內(nèi)毒素、zymozen等;②直接靜脈或腹腔注射活體病原菌例如細菌真菌等;③破壞動物自身的保護機制,讓細菌等腸內(nèi)容物外漏、移位。目前為止,常用的模型是盲腸結(jié)扎穿孔模型。Huber-Lang等早在20世紀70年代就建立了該模型,經(jīng)過多年的研究論證,已經(jīng)證明CLP模型從血液動力學及細胞因子變化等方面與人極為相似,為研究敗血癥的發(fā)病機理提供了良好工具,也是應用最廣泛的模型之一。我們以規(guī)范的盲腸結(jié)扎穿孔模型(CLP)來模擬臨床敗血癥的病理變化。兩者除了同時存在多種病原菌的混合感染外,還具有一致的炎癥反應過程,即敗血癥發(fā)病初期,炎癥系統(tǒng)被廣泛激活,免疫細胞損傷(凋亡)及組織器官的病理學改變等。為了觀察盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)手術(shù)對小鼠整體狀況的影響,我們首先觀察了CLP術(shù)后動物的整體生存狀況,實驗小鼠表現(xiàn)為:毛發(fā)枯槁、活動能力弱、身體脫水、呈惡性消耗型體質(zhì)。結(jié)果顯示,CLP術(shù)后動物整體生存水平(20%左右)與文獻報道相符合,實驗重復性較好,可以應用該模型進行發(fā)病機理研究。敗血癥是機體的系統(tǒng)性炎癥反應,過度的免疫應答反應導致各細胞因子之間的相互調(diào)控關(guān)系受到破壞,免疫平衡出現(xiàn)紊亂。為了觀察我們的模型是否存在炎癥介質(zhì)大量釋放等免疫紊亂狀況,本研究對CLP手術(shù)后一些炎癥介質(zhì)如C5a、IL-6、TNF-α、IFN-γ等的變化進行了檢測。本實驗結(jié)果顯示CLP手術(shù)后有大量炎癥介質(zhì)的釋放,表明我們的模型能很好地模擬臨床敗血癥的免疫紊亂現(xiàn)象。敗血癥發(fā)病初期,炎癥系統(tǒng)被廣泛激活,其中包括體液和細胞兩部分防御系統(tǒng)。各類炎性因子及細菌的直接破壞作用使得大量淋巴細胞發(fā)生凋亡,出現(xiàn)免疫抑制狀態(tài),其中發(fā)生凋亡的淋巴細胞主要是B淋巴細胞及CD4+T淋巴細胞;淋巴細胞的凋亡使機體產(chǎn)生抗體、活化巨噬細胞的功能受到影響,阻礙了病原菌的及時清除,是機體免疫功能受損的基礎(chǔ),也是導致多器官功能衰竭的重要因素。本研究也觀察到了CLP手術(shù)后淋巴細胞大量凋亡的現(xiàn)象。臨床研究發(fā)現(xiàn),敗血癥發(fā)生后多數(shù)病人因不能將體內(nèi)病原菌、各類毒素清除,會出現(xiàn)多器官功能衰竭。為了進一步驗證敗血癥發(fā)生后機體各臟器生理功能受損的物質(zhì)基礎(chǔ),我們對手術(shù)后的急性期(20小時)的胸腺和