棉花規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術研究進展

棉花規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術研究進展

1棉棉轉(zhuǎn)向技術研究與應用棉花是世界上最重要的纖維木材和重要的油材料之一。常規(guī)遺傳育種方法和手段雖然在提高棉花產(chǎn)量和抗性方面取得了長足的發(fā)展,培育成了一系列的優(yōu)良品種,但在解決棉花棉鈴蟲、黃萎病、提高纖維品質(zhì)等問題上遇到了巨大的挑戰(zhàn)。棉花是目前少有的幾種已投入商品化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物之一,自1996年轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉投入商品化后,轉(zhuǎn)抗除草劑基因棉、抗逆棉也相繼進入生產(chǎn)試驗階段,同時棉花基因工程在抗病、抗旱、耐鹽等方面的研究也初見端倪,近年來轉(zhuǎn)基因技術的應用,使棉花的基礎與應用研究日新月異(表1)。在棉花轉(zhuǎn)基因研究與應用的初期,主要以建立轉(zhuǎn)基因體系為主,目的基因為標記基因和不同類型的Bt基因,受體材料主要是美棉coker201或coker312,該材料轉(zhuǎn)化率較高,但在中國其農(nóng)藝性狀不佳。國內(nèi)則首先以抗蟲基因等為目的基因,以生產(chǎn)中應用的棉花新品種為受體開始建立體系并獲得大量轉(zhuǎn)基因材料?；ǚ酃芡ǖ婪ㄔ诿藁ㄞD(zhuǎn)基因初期曾大量應用,隨著農(nóng)桿菌介導法的逐步成熟,該方法的應用比重逐步加大。部分新方法如祝水金等的莖尖農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法也開始取得成功。近年來,RNAi等在棉花中也取得較大進展,更多研究者將功能基因?qū)朊藁╗20,21,22,23,24,25],建立轉(zhuǎn)基因體系,獲得新基因的功能。在國內(nèi),轉(zhuǎn)基因抗蟲棉已大量種植。棉花的轉(zhuǎn)基因技術的基礎是組織培養(yǎng),而棉屬的組織培養(yǎng)在作物中是最難的一個。從1971年Beasley首次報道從陸地棉的胚珠誘導出愈傷組織,直到1986年,Shoemaker等才報道了陸地棉珂字棉312和珂字棉201的再生植株。經(jīng)過近20年的發(fā)展,國內(nèi)外研究已經(jīng)獲得了戴維遜氏棉(GossypiumdavidsoniiKellogg)、雷蒙德氏棉(GossypiumraimondiiUlbrich)、瑟伯氏棉(GossypiumthurberiTodaro)、擬似棉(GossypiumgossypioidesUlbrich)、草棉(GossypiumherbaceumL.)、亞洲棉(GossypiumarboreumL.)、海島棉(GossypiumbarbadenseL.)和陸地棉(GossypiumhirsutumL.)等棉種的再生植株,并建立起了體細胞培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)、胚珠和胚培養(yǎng)以及原生質(zhì)體培養(yǎng)等不同的培養(yǎng)體系。很多實驗室通過胚胎發(fā)生途徑獲得了棉花(主要是陸地棉)再生植株,并建立一些棉花組織培養(yǎng)的體系。1.1由外植體轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢的基因資金轉(zhuǎn)化技術目前,在棉花中用于遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導法、基因槍轟擊法和花粉管通道法3種。農(nóng)桿菌介導法:農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法可以高效地將外源基因整合到棉花基因組中,外源基因可以穩(wěn)定遺傳和高效表達,它必須以組織培養(yǎng)為基礎。自1987年,Umbeck等和Firoozabady等先后報道了農(nóng)桿菌介導的棉花遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化植株以來,國內(nèi)外研究者先后建立了以珂字棉等品種為受體的再生體系,并取得巨大進展[6,34,35,36,37,38,39,40],為棉花重要基因的功能驗證和利用等工作提供了良好的技術平臺。在機理研究方面,棉花體細胞胚發(fā)生過程中體細胞胚起源、形態(tài)建成和胚胎學發(fā)育等相關的研究報告較多。此外,棉花體細胞胚發(fā)生和再生過程中常伴隨著大量的畸形胚和畸形苗,與此相關的研究也有報道。在棉花的組織培養(yǎng)性狀等方面已進行了諸多研究:不同類型外植體的體細胞胚能力差別很大,即使在同一品種棉花不同外植體的體細胞胚發(fā)生能力也存在很大的差異。體細胞胚發(fā)生能力以下胚軸最容易,子葉較差,真葉和莖最差。目前,陸地棉的組織培養(yǎng)主要以下胚軸為外植體,通過脫分化和再分化得到再生植株。張朝軍等發(fā)現(xiàn)中棉所24號的葉柄也具有較強的分化能力,并在基礎上建立了以葉柄為外植體轉(zhuǎn)化體系?；驑屴Z擊法:基因槍轟擊法是繼農(nóng)桿菌介導法之后在棉花轉(zhuǎn)化中應用最廣泛的一項技術。該方法具有受體類型廣泛(莖尖、下胚軸、胚性細胞懸浮系等均可以作為轉(zhuǎn)化的受體)、受體無基因型限制(很多的棉花品種已經(jīng)通過該方法得到了轉(zhuǎn)基因植株,部分的品種已經(jīng)商業(yè)應用)等優(yōu)點。1987年,美國Cornell大學的Klein等首次以洋蔥表皮細胞為材料,以鎢粉為子彈,把DNA、RNA導入細胞,且觀察到外源基因能表達,證明了基因槍轟擊轉(zhuǎn)化方法的可行性。1990年,美國俄亥俄州立大學的John等第一次將此技術應用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化中。目前報道的棉花基因槍轉(zhuǎn)化效率只有4%左右,有很大的提升潛力。影響基因槍轉(zhuǎn)化效率的因素很多,主要分為物理因素、生物因素和培養(yǎng)程序等?；驑尫ǘ嘁悦藁ㄅ咝杂鷤M織和莖尖分生組織作為受體材料,以1μg·μL-1的高純度質(zhì)粒包裹金粉粒,進行轟擊?，F(xiàn)在,筆者實驗室篩選出轉(zhuǎn)化效率較高的3種載體pBI-121、pCAMBIA2300和pCAMBIA2301,并成功建立了規(guī)?；驑屴Z擊轉(zhuǎn)化體系,每周轟擊100—150槍,轉(zhuǎn)化效率可達到4%以上?；驑屴D(zhuǎn)化后的培養(yǎng)較為重要,其中恢復培養(yǎng)和抗性篩選兩個過程尤為重要。隨著研究的開展,基因槍的轉(zhuǎn)化率由原來的0.001%—0.01%提高到4%左右,其轉(zhuǎn)化周期縮減為3—4個月,成功率高達94.1%。年轉(zhuǎn)化規(guī)模,例如中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所(以下簡稱“中棉所”)等,可達到約1200轉(zhuǎn)化體/年?；ǚ酃芡ǖ擂D(zhuǎn)化法:1979年發(fā)表的“遠緣雜交的分子基礎DNA片段雜交假設的一個論證”一文,為花粉管導入外源DNA的整合奠定了理論基礎。1983年,Zhou等在“MethodsinEnzymology”雜志上報道了棉花花粉管導入外源DNA獲得成功的文章。這一技術的建立為活體基因的轉(zhuǎn)化開創(chuàng)了新途經(jīng)。Trolinder等報道的一種原位轉(zhuǎn)化方法并申請了專利。通過子房注射法技術,已將抗蟲、抗病、抗除草劑、纖維品質(zhì)改良等不同基因?qū)朊藁ㄆ废?獲得了轉(zhuǎn)基因棉株。目前,棉花轉(zhuǎn)化中,通過此方法已得到了多個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種(品系),其中部分已經(jīng)審定并在生產(chǎn)上大面積推廣應用。但該方法受環(huán)境和人為操作等因素的影響大,轉(zhuǎn)化過程仍帶有相當?shù)碾S機性,轉(zhuǎn)化率比較低,外源基因的插入多拷貝比例較高。隨著分子生物學和基因工程的發(fā)展,外源DNA可通過花粉管通道導入植物胚囊這一事實越來越多地被許多學者所證實,同時也說明DNA片段雜交的存在。應用這一技術存在的問題:應用總DNA片段的導入,篩選到的子代仍可能帶入目的基因以外的片段。這一技術局限在于只能用于開花植物,且只有花期可以進行轉(zhuǎn)育。方法雖然簡單,但外源基因能否與受體基因整合,決定于目的基因的性狀與功能是否與受體基因組DNA和細胞代謝相容。在自然田間進行操作,受環(huán)境條件的影響很大。外源基因的導入具有很大的隨機性。目前,雖然建立了一些棉花的再生體系,中棉所還發(fā)展出了以中棉所24號模式轉(zhuǎn)化品種的規(guī)?；D(zhuǎn)基因體系。但從整體上看,受體材料選擇范圍狹窄等問題仍然制約著生物技術在棉花生產(chǎn)中的廣泛應用。為拓寬轉(zhuǎn)化的受體范圍,基因型對棉花體細胞胚發(fā)生能力的影響及其遺傳機制一直是研究的熱點,這對再生性狀相關基因的定位、克隆及解釋再生能力品種依賴性等問題具有重要的意義。至2005年,中棉所對棉花轉(zhuǎn)基因技術體系進行多年研究,建立起以農(nóng)桿菌介導法、花粉管通道法為主,基因槍轟擊法為輔的三位一體棉花規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術體系。該體系已將雙價抗蟲基因、反式抗棉蚜基因、棉纖維品質(zhì)改良基因、雄性不育基因等目的基因?qū)氲讲煌拿藁ㄆ贩N中,并達到了年產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植株2000株以上的水平。1.2抗蟲、抗病藥等方面的進展棉花是世界上轉(zhuǎn)基因研究與應用最成功的作物之一,在抗棉鈴蟲、抗除草劑等方面已取得巨大成功。棉花是世界上播種面積居第四位的轉(zhuǎn)基因作物。到2013年,轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在中國占棉花播種總面積的85%以上。表2是目前已產(chǎn)業(yè)化的基因及品種。2總體材料的基因組織轉(zhuǎn)化在轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ椀软椖康馁Y助下,中棉所與國內(nèi)相關研究單位合作,建立了棉花規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術體系,對農(nóng)桿菌介導法、基因槍轟擊法、花粉管通道法進行了大量研究與改良,驗證了大量功能基因與載體,累計培育了2000余份棉花新材料。以下內(nèi)容主要是該轉(zhuǎn)基因體系的主要進展,主要數(shù)據(jù)不再另文發(fā)表。以擴大轉(zhuǎn)基因受體材料基因型為目標,利用篩選出的優(yōu)良載體,結(jié)合已驗證功能的目的基因,以50余個棉花品種(系)為轉(zhuǎn)基因受體,同時進行培養(yǎng)體系的適當優(yōu)化,建立了27個品種(系)的轉(zhuǎn)基因技術體系。以轉(zhuǎn)化率為依據(jù),可將這些材料分成3類:Ⅰ總體轉(zhuǎn)化率5%以上的5個品種:CRI24、冀合321、冀合713、泗棉3號、魯棉6號。其中,CCRI24成為中國棉花轉(zhuǎn)基因的模式品種;Ⅱ總體轉(zhuǎn)化率0.5%—4.9%的9個品種:CRI27、CRI13、CRI19、CRI17、CRI35、中51504、中135、中394;Ⅲ總體轉(zhuǎn)化率0.5%以下的11個品種(系):中8036、中2468、中8037、CRI12、中3316等14個品種(系)。為進一步提高這些材料的轉(zhuǎn)化效率,利用建立的棉花葉柄組織培養(yǎng)技術體系,以棉花大田活體材料的葉柄為外植體,進行組織培養(yǎng),篩選其中的高分化率材料(表4),其中W12、W13等5個單株的分化率可達100%,而W07等單株在該培養(yǎng)體系中不分化。將分化率達100%的W12自交純合后,以其為新的轉(zhuǎn)化受體,使轉(zhuǎn)基因過程中轉(zhuǎn)化率提高了約2.55倍。張朝軍等進一步通過分子標記研究發(fā)現(xiàn),單株間分化率的差異受2個分子標記控制。雖有少數(shù)研究宣稱建立了直接發(fā)生途徑的轉(zhuǎn)化體系,但棉花的農(nóng)桿菌介導法目前仍然以間接發(fā)生為主,需要經(jīng)過胚性愈傷—胚狀體的階段,且該階段為棉花農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化的關鍵步驟。利用選育的高分化率材料,建立了穩(wěn)定的棉花無菌苗下胚軸組織培養(yǎng)體系。用的組織培養(yǎng)體系是本課題建立的CCRI24的模式化培養(yǎng)體系,由以下5種培養(yǎng)基組成:Ⅰ無菌苗培養(yǎng)基MS0:MS培養(yǎng)基的大量元素+25g·L-1蔗糖+2.5g·L-1Gel,加自來水定容到1L;Ⅱ愈傷組織誘導培養(yǎng)基MSB5:MSB培養(yǎng)基附加IAA、KT、2,4-D各0.1mg·L-1,并附加25g·L-1的葡萄糖,2g·L-1Gel,pH=6.5;Ⅲ分化培養(yǎng)基MSB6:MSB附加0.05mg·L-1IAA+0.15mg·L-1KT+25g·L-1葡萄糖+2.5g·L-1Gel,pH=6.5;Ⅳ胚性愈傷增殖培養(yǎng)基MSB7:MSB培養(yǎng)基,附加0.1mg·L-1KT+0.15mg·L-16-BA,pH=6.8;Ⅴ胚狀體萌發(fā)成苗培養(yǎng)基MSB8:MSB培養(yǎng)基附加0.1mg·L-1KT+0.2mg·L-16-BA+25g·L-1蔗糖+2.5g·L-1Gel,pH=6.8。利用上述20個株系所建立的高效再生技術體系進行農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化,保證了外源基因經(jīng)過一次遺傳轉(zhuǎn)化,700個外植體就可以得到200個左右的獨立轉(zhuǎn)化體。經(jīng)5—6個月后就可以獲得轉(zhuǎn)基因再生植株,然后進入外源基因功能評價體系。以該體系為主的“棉花組織培養(yǎng)性狀純化及外源基因功能驗證平臺構建”2010年獲國家發(fā)明二等獎。棉花農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化的流程如圖1。在筆者建立的農(nóng)桿菌介導體系中,在原有轉(zhuǎn)化體系的基礎上,主要進行了以下改良:2.1.3.分子身份證的發(fā)現(xiàn)和應用此步驟是棉花農(nóng)桿菌介導的關鍵步驟,培養(yǎng)基的調(diào)整至關重要。由于不同載體及不同愈傷組織對培養(yǎng)基的需要都有所不同,在此將調(diào)整的原則概述如下:降低激素的用量可提高胚性愈傷組織的發(fā)生率:過高的激素含量會使愈傷組織水化嚴重且不易分化,但若愈傷組織硬化則證明過低。愈傷組織繼代的時機也非常重要:大約40d的愈傷組織比較適合繼代,此時的愈傷一般呈現(xiàn)暗黃色、較酥松。一般不需要懸浮培養(yǎng),因為該處理容易引起細胞的大量變異。為檢測培養(yǎng)體系是否合適,可采用鏡檢:將愈傷組織直接在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光。在卡那霉素抗性愈傷組織、胚性愈傷組織、非胚性愈傷組織和體細胞胚中均可以檢測到GFP的熒光信號,抗性愈傷組織中有90.0%—96.0%的轉(zhuǎn)化系可以觀察到GFP熒光(圖2),若細胞結(jié)構完整、團狀大小適中,基本可表明培養(yǎng)體系較合適。由于棉花的離體再生仍然存在嚴重的基因型限制,國內(nèi)外諸多研究者試圖利用分子標記技術以發(fā)現(xiàn)其遺傳標記,從而篩選出更適合于遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。Gawel等研究認為再生能力可以遺傳,為數(shù)量性狀。張家明等提出品種的局限性具有一定規(guī)律,在美國愛字棉和斯字棉系統(tǒng)難再生,岱字棉極難或不能再生,珂字棉系統(tǒng)最易再生;在中國,黃河流域品種容易,長江流域品種困難。一個封閉基因系統(tǒng)(blockergenesystem)控制著再生性狀。張朝軍等發(fā)現(xiàn)CRI2對主基因的加性效應均為正值,均使分化率提高。2個F2群體顯示的主基因遺傳率分別為83.22%和74.68%,多基因遺傳率分別為10.47%和16.78%。Xu等為深入了解棉花體細胞胚胎發(fā)生(SE)的分子機制,用RNA-Seq方法對不同的姐妹系間體細胞胚胎發(fā)生的轉(zhuǎn)錄組動態(tài)進行分析。214977462個讀長從頭拼接得到204349個Unigenes。qRT-PCR驗證基因表達與RNA-Seq測序結(jié)果正相關(R2=0.841,在0.01水平顯著相關)。培養(yǎng)基中植物激素(生長素和細胞分裂素)濃度比的不同和這兩種激素在不同姐妹系間2個時期的內(nèi)源含量變化暗示生長素和細胞分裂素在棉花體細胞胚胎發(fā)生中的作用。所有調(diào)控植物激素相關基因中,差異表達轉(zhuǎn)錄本有很多基因涉及到生長素與細胞分裂素合成、信號轉(zhuǎn)導途徑,參與這些途徑的差異表達基因分析揭示了2個姐妹系間基因類型及表達豐度發(fā)生了實質(zhì)變化。分離、克隆、沉默/過表達這些在棉花體細胞胚胎發(fā)生過程顯著上調(diào)或下調(diào)的基因極其重要。此外,生長素和細胞分裂素在SE中發(fā)揮主要作用,但彼此或與其他因素間潛在的相互作用仍不清楚。2.2基因槍擊穿轉(zhuǎn)化法在建立的轉(zhuǎn)基因技術體系中,對棉花基因槍轟擊體系進行了大量改良,主要是對外植體的選擇、篩選標記的擴展等方面?；驑屴Z擊轉(zhuǎn)化法的流程基本如下:外植體→質(zhì)粒DNA轟擊→恢復培養(yǎng)→篩選培養(yǎng)→嫁接→移栽→分子檢測→收獲種子進行田間篩選。在此流程中,主要針對其中的部分關鍵步驟進行了改良。2.2.1胚性愈傷組織的撞擊以棉花組織培養(yǎng)獲得的胚性愈傷組織取代了頂端分生組織,使轉(zhuǎn)化規(guī)模擴大2—3倍。以組織培養(yǎng)獲得的CRI24、CRI12等材料的胚性愈傷組織為外植體,經(jīng)過3mol·L-1山梨醇滲透液體振蕩培養(yǎng)1—1.5h,過濾出細沙粒狀愈傷組織,濾紙上吸去培養(yǎng)液,晾干后即可進行轟擊,一般選擇轟擊2—3次。此方法可加大轟擊頻率1—2倍,以往以采用頂端分生組織為主,需要大量時間進行解剖鏡下剝離出它們,每人每天只能轟擊約10個處理,每周只能轟擊2—3d,采用胚性愈傷組織后,每周可轟擊4d,每次15—20個處理。但此方法只能適用于已建立了組織培養(yǎng)體系的受體材料,尚未建立的材料仍然需要以頂端分生組織為外植體。2.2.2篩選材料及用量建立了以潮霉素、草甘膦等為篩選標記的基因槍轟擊轉(zhuǎn)化體系,以抗蟲棉為受體可大量獲得轉(zhuǎn)基因材料。棉花對潮霉素和草甘膦都比較敏感,相對于卡那霉素,需降低培養(yǎng)基中篩選物資的濃度,目前潮霉素以5ppm開始篩選,經(jīng)過3次梯度增高至25—30ppm,即可獲得5%—10%的抗性愈傷組織,其獲得的轉(zhuǎn)基因材料約2/3為陽性植株。以草甘膦為篩選標記時,其對應濃度分別為0.5和5ppm。由于目前國內(nèi)的轉(zhuǎn)基因材料在長江流域、黃河流域已大量種植,近年來的天氣異常使獲得足質(zhì)足量常規(guī)棉為受體的難度日益加大。因此,這些轉(zhuǎn)基因體系的建立具有明顯的促進作用,但會加大轉(zhuǎn)基因安全性評價的難度。2.2.3降低嵌合體比例采取必要的措施降低嵌合體:其一,必要時可對質(zhì)粒DNA進行酶切。其二,加大篩選強度可適當降低嵌合體比例(但會降低轉(zhuǎn)化規(guī)模)。其三,轉(zhuǎn)基因植株分子檢測后獲得的陽性植株需嚴格自交,盡量分單鈴收花,降低因嵌合體產(chǎn)生的后期材料選育的難度。2.3布氏原螯蝦對棉花的誘導誘導利用花粉管通道法在轉(zhuǎn)基因棉花的研究中主要有3種方法,包括子房注射法、真空滲透轉(zhuǎn)化法和柱頭滴加法。目前,主要以子房注射法為主。子房注射法(微注射法):一般方法是在棉花盛開期,選擇白花授粉后24h左右取自交受精的隔日幼鈴(花冠由自色變紅色),抹平花柱,用合適的注射器把外源DNA注射進棉花子房即可。棉花花粉管通道法轉(zhuǎn)化已培育了大量轉(zhuǎn)基因棉花新品種,如CRI41(2009年獲國家科技進步二等獎)等。為提高轉(zhuǎn)化率,筆者對諸多步驟進行了改良,需注意以下因素對轉(zhuǎn)化率的影響。3采用棉花分散轉(zhuǎn)移技術體系3.1抗蟲棉花轉(zhuǎn)化中棉所為棉花育種供了大量育種材料。其中,抗棉鈴蟲材料已培育大量轉(zhuǎn)基因棉花新品種(表6)。3.2其他研究單位近年來,利用已建立的棉花高效規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術,累計為專項其他課題國內(nèi)41家科研院所單位轉(zhuǎn)化基因234個。這些單位包括清華大學、北京大學、中國農(nóng)業(yè)大學、上海交通大學、復旦大學、中山大學、華南農(nóng)業(yè)大學、華中農(nóng)業(yè)大學、山東大學等大專院校以及中國科學院遺傳發(fā)育研究所、微生物研究所、植物生理研究所等,中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所、植物保護所等,山東省農(nóng)業(yè)科學院等研究單位。同時,創(chuàng)制了大量的具有應用潛力的育種新材料(表7)。例如,利用該平臺創(chuàng)制的第二代轉(zhuǎn)基因改善纖維品質(zhì)、提高作物產(chǎn)量等為主要目標的棉花新材料(RRM2、ACO1),經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準已面向全國30多家育種單位進行發(fā)放。通過棉花規(guī)模化轉(zhuǎn)基因技術體系為“973”、強優(yōu)勢“863”等專項外,其他課題驗證基因20個,累計創(chuàng)制不同類型的具有應用價值的轉(zhuǎn)基因育種材料510份,并提供給了“973”計劃項目“目的基因在棉花中的高效功能驗證及評價”、強優(yōu)勢“863”項目“強優(yōu)勢棉花雜交種的創(chuàng)制與應用”、“抗病及轉(zhuǎn)基因早熟棉花新品種培育”、“轉(zhuǎn)基因雜交棉花新品種培育”及“棉花產(chǎn)業(yè)體系等項目進行新品種培育研究”。4家的共同愿望長期以來培育具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲害、抗逆境等多個優(yōu)良性狀的棉花新品種,是每一個從事棉花遺傳改良科學家的共同愿望。為培育出育種需要的轉(zhuǎn)基因棉花材料,擴大轉(zhuǎn)基因材料的受體基因型仍然是棉花轉(zhuǎn)基因研究中首要問題。同時,為提高效率和減輕安全性的公眾焦慮,探索和發(fā)現(xiàn)新的更為安全和有效的轉(zhuǎn)化體系,如多基因共轉(zhuǎn)化、葉綠體轉(zhuǎn)化、標記基因刪除和新選擇標記等研究引起人們的普遍關注,是未來棉花轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展趨勢。4.1制備新材料的需要。在已經(jīng)設置擴大棉花轉(zhuǎn)基因受體材料基因型范圍、提高轉(zhuǎn)化效率、擴大轉(zhuǎn)化規(guī)模是棉花轉(zhuǎn)基因技術體系的長久主題。(1)擴大受體材料基因型范圍,是培養(yǎng)適合不同生態(tài)類型的轉(zhuǎn)基因棉花新材料的首要手段。中國棉花生態(tài)區(qū)氣候、土壤、種植模式等差異巨大,少數(shù)幾個品種為轉(zhuǎn)化受體無法滿足育種需要,因為目前已建立良好轉(zhuǎn)化體系的CRI24等材料已成為過時品種。近年來采用分子標記等方法已開始取得部分進展,但尚無法進行應用。目前擴大轉(zhuǎn)基因材料受體基因型的努力仍然局限于培養(yǎng)基和培養(yǎng)程序的改良上。(2)在提高轉(zhuǎn)化效率上,目前需要在載體構建、轉(zhuǎn)化體系改良等方面加大研究力度。(3)擴大轉(zhuǎn)化規(guī)模為篩選出更多更好的材料提供了更大可能。4.2新方法和新方法的應用已經(jīng)日新月異棉花在轉(zhuǎn)基因新型載體和新方法的研究已取得較大進展,但在TALEN等新技術上目前僅處于起步階段。4.2.1標記基因的篩選和多聚蛋白酶解法多基因轉(zhuǎn)化在棉花中已取得進展,并將逐漸在生產(chǎn)和研究中加大影響。多基因載體的構建策略主要有獨立表達框組合法、多聚蛋白酶解法。表達框組合法:目的基因的兩端均具有各自的啟動子、增強子、終止子等轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件,將多個表達框串聯(lián)在一起共同組建于一個表達載體中。采用這種構建方式時,須要先對融合蛋白的多個功能區(qū)的活性、穩(wěn)定性等特性進行驗證。調(diào)控原件的選擇,既要保證目的基因的特異性高效表達,又要避免使用相同調(diào)控序列而引起同源重組導致基因沉默。另外,篩選標記基因的選擇也十分重要,既要方便對多個目的基因的轉(zhuǎn)化后代的篩選,又要避免標記基因在受體材料中的積累。目前,篩選標記基因的安全問題頗受爭議,所以有時要考慮利用新型安全的選擇標記,或利用抗除草劑基因充當標記基因等。最后,載體上各元件的安排也需要慎重考慮。中棉所將已驗證功能的多個基因構建在同一個載體上,分別進行以抗蟲棉(載體為pBI121-IAP-RRM2-EPSPE-HS1-GUS)、常規(guī)棉(載體為pBI121-IAP-RRM2-P35-BT-EPSPE-HS1-GUS)為受體的轉(zhuǎn)化,并獲得了轉(zhuǎn)基因材料。該技術體系雖然有效,其試驗操作性比較復雜,組裝效率較低,還需要進一步改良簡化其操作和提高效率。多聚蛋白酶解法:將多個目的基因的內(nèi)含子序列融合在一起,構建在同一表達框(OFR)內(nèi),使多個基因在同一個調(diào)控元件下轉(zhuǎn)錄成為一個聚合mRNA,翻譯后得到一個由不同的功能多肽結(jié)合在一起而形成的融合蛋白。1994年,Salm等將含cryIA(b)和cryIC的融合蛋白基因表達載體成功地轉(zhuǎn)入到煙草和番茄中,獲得了抗多種害蟲的轉(zhuǎn)基因陽性植株?？紤]到所獲融合蛋白的結(jié)構、功能的復雜性及有時必須得到各目的基因的表達產(chǎn)物時,還可以在各基因之間插入編碼某個蛋白酶特異識別位點的DNA序列。這樣,融合蛋白一旦翻譯成多肽,就可以通過相應的酶解過程使其分離,表現(xiàn)出各自的功能,并且彼此間不受影響。需要注意的是,以往的將多種質(zhì)粒進行混合,再以農(nóng)桿菌介導或基因強轟擊進行的共轉(zhuǎn)化,因效率低、檢測難度極大、材料篩選困難等原因已基本被擯棄。隨著需要轉(zhuǎn)化的目的基因數(shù)量的增加,多基因表達載體的容量是一個重要的限制因素,所以有必要發(fā)展大容量的人工載體系統(tǒng),如YAC、BAC等表達載體系統(tǒng)。利用這些載體系統(tǒng)有可能實現(xiàn)多基因家族的連鎖轉(zhuǎn)化,同時還得發(fā)展相對應的基因轉(zhuǎn)化技術,將大容量載體有效地導人到棉花基因組中,提高轉(zhuǎn)化率并保證多個目的基因進行整合時不發(fā)生分離和丟失。4.2.2基因定點整合技術基因定點整合技術,是指構建在目的基因表達框兩端含有與受體基因組特定位點同源DNA片段的整合載體,通過各種轉(zhuǎn)化方法,使同源DNA序列與受體基因組序列之間發(fā)生同源重組,從而使目的基因插入到特定的受體基因組中,通過一系列的篩選培養(yǎng),最終得到定向轉(zhuǎn)化的再生植株?；蚨c整合載體可分為兩類:插入型載體和置換型載體。基因定點整合技術,不止用于外源基因的轉(zhuǎn)化,也可用于基因的定點刪除。目前,植物中成功利用基因定點整合技術的有煙草、擬南芥、水稻、玉米等,棉花中還未見定點整合技術應用的報道。目前,基因定點整合技術還存在著很多不足,整合頻率較低,只在煙草、水稻和玉米等少數(shù)作物上進行了運用。目前,基因定點轉(zhuǎn)化技術在棉花中的利用還存在著許多困難,但隨著人們對基因同源重組原理更深入的了解及棉花基因組信息的公布,棉花基因定點轉(zhuǎn)化技術會得到相應的改進和提高。2012年,中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所與中國科學院華南植物園DavidOw教授合作,開展了基因疊加轉(zhuǎn)基因的研究,構建了適宜于棉花的以重組系統(tǒng)為基礎的基因定點轉(zhuǎn)化載體,目前正在進行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化。4.2.3質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術是20世紀90年代興起的一項基因工程技術。質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化在一定程度上克服了核基因轉(zhuǎn)化的不足,具有獨特的優(yōu)越性:(1)高效表達:每個葉片中的質(zhì)體基因組拷貝數(shù)非常大,外源基因整合進去后,再生陽性植株的每片葉子的目的基因拷貝數(shù)必然極為極高,這就為基因的高效表達提供了條件。(2)原核表達系統(tǒng),大多目的基因無需修飾改造:由于質(zhì)體內(nèi)的表達為原核表達系統(tǒng),對于來自原核生物的或由mRNA反轉(zhuǎn)錄得來的具有重要價值的外源基因,無需改造和修飾就可在質(zhì)體內(nèi)高效表達,這是核基因轉(zhuǎn)化無法做到的。(3)安全性好:外源基因整合進質(zhì)體基因組后,只進行母系遺傳,不會隨花粉擴散,從而保證了基因工程的安全性。(4)便于遺傳操作,并可以實現(xiàn)定點整合:質(zhì)體基因組小,結(jié)構簡單,許多作物的質(zhì)體基因已被測序,正在進行深入的功能基因組學研究,其遺傳背景較清楚,便于遺傳操作。(5)易保持純系、后代不分離:一旦得到純合而穩(wěn)定的質(zhì)體轉(zhuǎn)化體,由于外源基因的母系遺傳特性,這種純系的種子后代將永遠保持為純系,不會因為有性雜交而發(fā)生分離。作為安全新型的轉(zhuǎn)化方法,質(zhì)體轉(zhuǎn)化還存在著轉(zhuǎn)化效率低、載體構建困難繁瑣等問題,還需進一步研究。美國已開始了棉花的葉綠體轉(zhuǎn)化,并成功獲得轉(zhuǎn)化質(zhì)體,華中農(nóng)業(yè)大學與其合作研究。在中國,中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所已構建了2個轉(zhuǎn)化載體,正在轉(zhuǎn)化中。棉花規(guī)?；|(zhì)體轉(zhuǎn)化體系會很快建立起來,并為棉花性狀的遺傳改良帶來新的生機和活力。4.2.4無選擇標記基因的研究目前,中國轉(zhuǎn)基因棉花的篩選標記多為卡那霉素抗性。以抗蟲棉為受體的許多潮霉素抗性的材料目前無法進入安全性評價,需要進行該標記的刪除,因此,需要無選擇標記體系的建立。目前,應用于標記基因刪除的分子生物學技術主要有4種:共轉(zhuǎn)化法、轉(zhuǎn)座子介導的再定位、同源重組法和定點敲除技術。棉花中,與中國科學院遺傳與發(fā)育研究所合作,開展雙T-DNA插入獲得無選擇標記轉(zhuǎn)化技術的研究。目前,已獲得轉(zhuǎn)基因再生單株。新型安全標記基因:為了消除公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性顧慮,學者們除了積極建立標記基因刪除體系之外,還努力研發(fā)新型的安全的篩選標記。隨著研究的深入,學者們發(fā)現(xiàn)了一些糖類代謝酶等正選擇標記基因、可實時監(jiān)控的熒光素酶類、熒光蛋白家族和GUS等報告基因、植物來源的耐脅迫類基因和一些安全的負選擇標記基因。這些標記基因不存在危害人類健康和環(huán)境安全的風險,又可快速的用于轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化應用。在棉花中pmi是最為成功的,山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所已建立了其轉(zhuǎn)化體系,并獲得了上千株轉(zhuǎn)化材料。5農(nóng)桿菌誘導法與其他方法的結(jié)合在棉花具有生產(chǎn)應用價值的基因太少。目前取得商業(yè)化生產(chǎn)的基因仍然為BT和EPSPS等少數(shù)幾個基因。大量新基因仍然處于材料階段,其主要原因在于:其一,基因的效應達不到競爭優(yōu)勢,尤其在數(shù)量性狀的改良上?；蜣D(zhuǎn)基因材料存在著顯著缺陷,尤其在產(chǎn)量上。這需要在載體構建上加大研究力度。其二,由于棉花的分子生物學技術相對困難,安全性評價所需要的證據(jù)難以取得。在插入片段完整性上具有較大困難,楊曉杰等研究發(fā)現(xiàn),對利用農(nóng)桿菌介導法獲得的轉(zhuǎn)基因棉花材料中,約50%的株系含有轉(zhuǎn)化載體上T-DNA外圍的側(cè)翼序列,尤其LB外側(cè)的載體序列出現(xiàn)頻率較高,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物也具有載體多余序列的插入?；谕瑯釉?由于安全性評價的要求提高,基因槍轟擊法和花粉管通道法獲得的材料通過安全性評價的可能性很低。農(nóng)桿菌介導法的基因型限制仍然很嚴重,尤其在生育期較長的材料上,而這些材料的產(chǎn)量和抗性更好,需要加大研究力度以建立起轉(zhuǎn)化體系。除對培養(yǎng)基等進行改良外,還可結(jié)合分子標記等新技術。當然,相對于煙草等模式作物,棉花的轉(zhuǎn)基因周期仍然偏長。需要在畸形苗的克服、胚性愈傷組織的誘導等方面加大研究力度?；蚊绗F(xiàn)象極大地消耗著勞動力、時間和金錢。若克服了此問題,可在現(xiàn)有基