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神經(jīng)生物學(xué)科研中心

分子生物學(xué)平臺(tái)張寶樂“從RNA提取到熒光定量PCR”的解決方案一、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄樣品收集提取RNA的樣品要保證“新鮮”

（屠宰后，立即放入液氮，過夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱）RNA提取

防止RNA酶的污染：DEPC處理150-180℃烘烤3-4hTrizol-氯仿（氯仿-異戊醇49:1）-異丙醇-75%乙醇試劑盒（離心柱濾膜吸附法）提取方法：RNA檢測(cè)

甲醛變性電泳:三條帶（28、18、5.8/5S）

紫外吸光值檢測(cè)：

OD260/280(1.8-2.0)

（＜1.7蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.1異硫氰酸殘存或降解）

OD260讀數(shù)（0.1-0.5）(線性關(guān)系好)

RNA得率=OD260*稀釋倍數(shù)*40ng/μl反轉(zhuǎn)錄

模版：

總RNA、mRNA、體外轉(zhuǎn)錄的RNA引物:oligo（dT）、隨機(jī)引物、基因特異引物(GSP)反轉(zhuǎn)錄酶：

防止RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的反轉(zhuǎn)錄失?。?/p>

RNA65℃5min，冰上3-5min，立即42℃反轉(zhuǎn)錄加入氫氧化甲基汞（CH3HgOH）或解鏈蛋白

使用耐受高溫（55-65℃）的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

利用內(nèi)參基因檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄效果，如GAPDH,β-actin等。利用普通PCR初篩定量引物

特異性、避免產(chǎn)生引物二聚體

產(chǎn)物長(zhǎng)度90-300bp之間

退火溫度：60℃左右（內(nèi)參和目的基因一致）考慮目標(biāo)剪接體（若基因存在可變剪切）盡量跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物Real-timePCR檢測(cè)

確定引物的有效性（擴(kuò)增曲線、熔解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線）二、Real-timePCR熒光定量PCR原理－－常用名詞概念擴(kuò)增曲線熒光閾值Ct值熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。NOTE:采用72℃延伸時(shí)采集熒光!95℃60℃左右NOTE:質(zhì)粒獲得后，用限制性內(nèi)切酶單酶切，使其線性化！

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