冷凍對(duì)姜曲海豬精子形態(tài)結(jié)構(gòu)及dna完整性的影響

冷凍對(duì)姜曲海豬精子形態(tài)結(jié)構(gòu)及dna完整性的影響

精細(xì)的長(zhǎng)期保存對(duì)動(dòng)物育種、低溫生物學(xué)資源的保存和動(dòng)物基因的研究具有重要意義。然而，在食品試驗(yàn)中，用冷凍豬精的比例為1%。此外，還有許多問(wèn)題，如冷凍后的活力差、產(chǎn)仔率低、產(chǎn)仔數(shù)少等。1.2。許多學(xué)者致力于豬冷凍精液的研究,但關(guān)于精子冷凍后DNA損傷及超微結(jié)構(gòu)研究較為缺乏。因此,本試驗(yàn)探索冷凍保存對(duì)豬精子DNA完整性及超微結(jié)構(gòu)的影響。1保溫桶內(nèi)溫度4只成年、健康、性欲旺盛的姜曲海種公豬由國(guó)家級(jí)姜曲海種豬場(chǎng)提供。利用手握法采集精液,立即置于保溫桶中,1h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。將精液用專用濾紙過(guò)濾至37℃預(yù)熱燒杯中,然后按照1∶1.5與稀釋液(德國(guó)米尼圖MII稀釋劑)進(jìn)行稀釋。1.2稀釋液和成分配液1.2.1冷凍基礎(chǔ)液的配置分別稱取葡萄糖1.1g,Tris2.42g,檸檬酸鈉1.48g,青霉素0.06g和鏈霉素0.1g,溶解于雙蒸水中,定容至100mL。1.2.2冷凍液的配置冷凍I液:海藻糖組(冷凍1組),在稀釋液的基礎(chǔ)上添加375mmol/L海藻糖、0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.05%維生素C和20%卵黃;乳糖組(冷凍2組),在稀釋液的基礎(chǔ)上添加375mmol/L乳糖、0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.05%維生素C和20%卵黃。冷凍Ⅱ液:在冷凍I液的基礎(chǔ)上添加甘油,使其終濃度為3%。1.2.3吖啶橙染色液的配置吖啶橙溶液:吖啶橙0.1g溶解于100mL蒸餾水中;枸櫞酸溶液:枸櫞酸1.91g溶解于100mL蒸餾水中;磷酸氫二鈉溶液:Na2HPO4·12H2O10.74g于100mL蒸餾水中。臨用時(shí),分別取吖啶橙染色液10mL、枸櫞酸溶液40mL、磷酸氫二鈉溶液7.5mL混合,即為吖啶橙染色液。1.3無(wú)定形液氮液的制備將1∶1.5稀釋后的精液置于17℃過(guò)夜,17℃離心(800g,12min),棄上清,然后加入冷凍I液于4℃平衡1.5h;再加入等體積4℃預(yù)冷的冷凍Ⅱ液,使精液最終稀釋比為1∶2,然后再于4℃平衡、分裝于0.25mL細(xì)管中,不超過(guò)45min,距液氮面3cm熏蒸10min,然后投入液氮保存7d。解凍時(shí),將細(xì)管從液氮中迅速取出,直接投入37℃水浴中并迅速搖晃。將解凍后的精液收集于10mL試管內(nèi),然后用9倍體積的PBS液清洗精子。1.4精子的計(jì)數(shù)于相差顯微鏡下直接觀察活精子的正常形態(tài)率,至少計(jì)數(shù)200個(gè)精子。將巨型精子,短小精子,雙頭或雙尾精子,頂體膨脹或脫落精子,精子頭部殘缺或與尾部分離、尾部變曲精子等,均視為畸形精子。1.5熒光顯微鏡觀察將精液用PBS洗3次,棄上清,調(diào)整精子濃度為2×104個(gè)/mL,涂片,自然晾干,無(wú)水乙醇-冰醋酸(3∶1)固定5min,然后置入盛有新鮮配制的吖啶橙染液的染色缸中染色10min。蒸餾水清洗,晾干后,石蠟油封片,于熒光顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)［3］。DNA雙鏈完整的精子呈現(xiàn)綠色,表明有受精能力;DNA雙鏈損傷的精子呈現(xiàn)紅色或黃色,表明無(wú)受精能力,計(jì)數(shù)300個(gè)精子。1.6精子的制備新鮮和試驗(yàn)1組冷凍-解凍精子樣本于2.5%戊二醛中4℃固定6h,再經(jīng)PBS清洗3次,1次30min;隨后,將精子包埋于4%瓊脂中,再于1%鋨酸(OsO4)中固定1.5h,然后再經(jīng)PBS清洗3次［4］;之后,乙醇逐級(jí)脫水,乙酸異戊脂置換;臨界點(diǎn)干燥儀干燥,IB-5離子濺射儀噴金,掃描電子顯微鏡(SEM)觀察、拍照。1.7處理數(shù)據(jù)所獲試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。2結(jié)果2.1冷凍-解凍豬精子的組織在掃描電鏡下,豬新鮮精子(圖1-A、B)頭、頸、尾結(jié)構(gòu)完整;頭部由細(xì)胞核和頂體組成;頂體結(jié)構(gòu)完整,邊界清晰,邊緣整齊,局部無(wú)隆起,表面無(wú)空洞;尾部完整。冷凍-解凍后,豬精子頭部和頸部發(fā)生全部或部分?jǐn)嗔?圖1-C、D、E),頸部腫脹(圖1-E);頂體結(jié)構(gòu)損傷(圖1-E)或消失僅見(jiàn)核結(jié)構(gòu)(圖1-F)。2.2冷凍2組患者精子形態(tài)正常率和dna完整率由表1可見(jiàn),冷凍1組、冷凍2組及新鮮對(duì)照組間精子形態(tài)正常率和DNA完整率均存在顯著差異(P<0.05),且冷凍1組和冷凍2組精子的形態(tài)正常率和DNA完整率又顯著低于新鮮精子(P<0.05)。冷凍1組的形態(tài)正常率及DNA完整率又顯著高于冷凍2組(P<0.05)。3冷凍過(guò)程對(duì)精子的影響精子的受精能力與精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)［5］。頂體位于精子頭部前端,其內(nèi)含有多種與受精相關(guān)的酶。精卵融合前精子必須發(fā)生頂體反應(yīng),頂體酶才能發(fā)揮作用［6］?？梢?jiàn),完整的頂體結(jié)構(gòu)是正常頂體反應(yīng)的基礎(chǔ)。精子細(xì)胞作為遺傳物質(zhì)的主要傳遞者,其DNA完整程度直接關(guān)系到精子質(zhì)量及其后代的生長(zhǎng)發(fā)育［7］。本研究發(fā)現(xiàn),冷凍后豬精子形態(tài)結(jié)構(gòu)及DNA完整率均顯著低于新鮮精子。在掃描電鏡下,冷凍精子頭頸結(jié)合處斷裂、頸部腫脹、頂體結(jié)構(gòu)損傷或消失。許多研究結(jié)果表明,冷凍損傷是低溫冷凍任何哺乳動(dòng)物精子所難以避免的。冷凍損傷主要與細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成所致的機(jī)械性損傷及滲透壓改變所致的化學(xué)性損傷［8－9］、細(xì)胞膜功能紊亂［10］和Na+-K+-ATP酶障礙［11］等因素有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn),添加海藻糖組的冷凍精子形態(tài)完整率和DNA完整性均比添加乳糖組的高,表明海藻糖對(duì)豬精子冷凍保存具有較好的保護(hù)作用,這與張樹(shù)山等的研究結(jié)果［12］一致。海藻糖是一種非常穩(wěn)定的非還原性雙糖,在冷凍過(guò)程中,可以在細(xì)胞膜外產(chǎn)生一種玻璃狀的防護(hù)層,從而提高細(xì)胞對(duì)高滲透的耐受性,具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性［13］。冷凍過(guò)程中,精子核蛋白對(duì)DNA雙鏈的保護(hù)作用被削弱,造成精子線粒體與核基因組的DNA損傷,DNA雙鏈變性為單鏈DNA,該損傷可能是造成胚胎發(fā)育不良和流產(chǎn)的主要原因。李剛琴等的研究結(jié)果表明,精子DNA易受活性氧的攻擊,造