辛伐他汀對(duì)增齡大鼠腰椎椎體骨形成功能的影響

辛伐他汀對(duì)增齡大鼠腰椎椎體骨形成功能的影響

托吡魯酯是一種傳統(tǒng)的抗高血壓藥物。它是3-羥色胺（hmg-coa）的還原劑。抑制膽固醇代謝的延遲酶hmg-coa可抑制二甲基硝酸（mva）的產(chǎn)生，降低有害低密度血脂（ldl-c）的水平。Mundy等于1999年首次報(bào)道了他汀類藥物具有促進(jìn)骨代謝合成的生物學(xué)作用,此后他汀類藥物成為了促進(jìn)骨形成藥物研發(fā)的新興熱點(diǎn)。目前臨床中應(yīng)用最廣泛的是辛伐他汀,故選取辛伐他汀作為研究對(duì)象,具有突出的現(xiàn)實(shí)意義。近年來,辛伐他汀在體外對(duì)細(xì)胞系或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有促進(jìn)成骨分化和抑制成脂分化的雙向作用已被證實(shí),但他汀類藥物在增齡動(dòng)物模型的體內(nèi)研究報(bào)道甚少。此外,骨質(zhì)疏松癥所致的骨折中腰椎椎體的發(fā)生率為最高,約占50%,選擇腰椎椎體為研究對(duì)象則更具有較為現(xiàn)實(shí)的臨床意義。本研究選擇15月齡的老年雄性大鼠構(gòu)建增齡模型(Ⅱ型老年性骨質(zhì)疏松),依據(jù)他汀類藥物的臨床毒性試驗(yàn)和等效藥量換算比例選擇不同劑量的辛伐他汀,觀察其對(duì)腰椎椎體骨形成功能的影響,以期能夠真實(shí)地評(píng)價(jià)辛伐他汀對(duì)骨質(zhì)疏松癥的軀干骨骼是否具有促進(jìn)骨形成的防治作用。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14月齡雄性SPF級(jí)SD大鼠,由中英合資上海BK實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2研究方法雙能X線骨密度儀(HOLOGIC,美國),周圍定量CT(XCTResearchSA,德國),萬能材料試驗(yàn)機(jī)(LLOYDEZ20,英國),硬組織切片機(jī)(LeicaSP1600,德國),辛伐他汀片(杭州默沙東,美國),鹽酸四環(huán)素(華美制藥,中國)。1.3灌胃、病料、動(dòng)物14月齡雄性SD大鼠60只,經(jīng)消毒飼料(Ca0.5%,P0.4%)喂養(yǎng)1個(gè)月后得實(shí)驗(yàn)用15月齡大鼠。辛伐他汀片以生理鹽水制成混懸液灌胃,現(xiàn)用現(xiàn)配,分為5、10、20、40mg/kg/d4個(gè)劑量。15月齡雄性SD大鼠每組10只,包括劑量組、對(duì)照組(灌服等劑量的生理鹽水)和基線組共計(jì)6組。劑量組和對(duì)照組觀察時(shí)間為3個(gè)月,18月齡時(shí)取材。基線組于灌胃開始時(shí)即處死取材。各組動(dòng)物飼養(yǎng)期間每?jī)芍軠y(cè)量體重以調(diào)整用藥量,均以2.5%戊巴比妥鈉麻醉過量致死,處死前12d及2d腹腔內(nèi)皆注射鹽酸四環(huán)素25mg/kg。1.4觀察指標(biāo)1.4.1骨密度測(cè)定動(dòng)物處死后,取第4腰椎利用雙能X線骨密度儀(HOLOGIC,美國)進(jìn)行骨密度(bonemineraldentisty,BMD)測(cè)定。檢測(cè)后置入70%酒精,4℃固定。1.4.2模擬骨強(qiáng)度力學(xué)性能上述70%酒精固定第4腰椎送檢pQCT。掃面層厚0.8mm,分辨率0.09mm。椎體:正中冠狀面。檢測(cè)后置于4℃保存。檢測(cè)指標(biāo):總骨含量(TOT_CNT),總骨密度(TOT_DEN),總面積(TOT_A),小梁骨含量(TRAB_CNT),小梁骨密度(TRAB_DEN),小梁骨面積(TRAB_A),皮質(zhì)骨含量(CRT_CNT),皮質(zhì)骨密度(CRT_DEN),皮質(zhì)骨面積(CRT_A),皮質(zhì)厚度(CRT_THK_C),皮質(zhì)骨外周長(zhǎng)(PERI_C),皮質(zhì)骨內(nèi)周長(zhǎng)徑(ENDO_C),X、Y、Z3個(gè)軸向的模擬骨強(qiáng)度力學(xué)性能(SSI)。1.4.3甲基丙烯酸甲酯mma和過氧化苯甲酰bpo的制備第4腰椎乙醇逐級(jí)脫水:80%、90%和95%酒精各24h,最后100%酒精48h;二甲苯透明24h;純甲基丙烯酸甲酯(MMA)浸泡3d,甲基丙烯酸甲酯(MMA)+1g過氧化苯甲酰(BPO)浸泡3d,甲基丙烯酸甲酯(MMA)+2.5g過氧化苯甲酰(BPO)浸泡3d,轉(zhuǎn)至37℃烘箱內(nèi)至固化。硬組織切片機(jī)切片至50μm。ImagePlus5.0計(jì)算四環(huán)素標(biāo)記雙線間距離/標(biāo)記間隔時(shí)間。1.4.4尾兩端圍巖應(yīng)力應(yīng)變分析將第5腰椎自-20℃冰箱中取出后逐級(jí)復(fù)溫,剪去周圍附件,以低速電鋸修整頭尾兩端為互相平行的截面,以千分尺分別測(cè)量頭尾兩端的前后徑、內(nèi)外徑和椎體高度,置于水平金屬平臺(tái)上,傳感器最大量程500N,預(yù)加載荷5N,最大應(yīng)變?yōu)?mm,試驗(yàn)機(jī)加載速度0.5mm/min,設(shè)定負(fù)荷下降至60%為樣品破裂。1.5統(tǒng)計(jì)分析用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn),各動(dòng)物組間的差異用Tukey法比較,P<0.05為顯著差異。2結(jié)果2.1x線的骨密度測(cè)試2.1.1劑量組和對(duì)照組10mg組BMD等于對(duì)照組,其余各組皆低于對(duì)照組;其中,5mg組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05),其余組間無明顯差異。2.1.2劑量下降40mg組、20mg組、10mg組隨劑量下降BMD呈上升趨勢(shì),5mg組BMD則下降,5mg組的BMD明顯低于10mg組(P<0.05),其余組間無明顯差異。2.1.3基站組vs對(duì)照組對(duì)照組BMD低于基線組,但無明顯差異(見表1)2.2pqct分析見圖12.2.1兩組患者不同時(shí)點(diǎn)壓力比較總骨含量、皮質(zhì)骨含量和松質(zhì)骨含量對(duì)照組最高,其中松質(zhì)骨含量對(duì)照組與5mg組差異顯著,其余組間無明顯差異?？偣敲芏群退少|(zhì)骨密度對(duì)照組低于10mg組,但組間無明顯差異;皮質(zhì)骨密度對(duì)照組最高,與20mg組差異明顯?？偣敲娣e、皮質(zhì)骨面積和松質(zhì)骨面積對(duì)照組最高,其中松質(zhì)骨面積對(duì)照組與5mg組差異顯著,其余組間無明顯差異。模擬壓縮強(qiáng)度對(duì)照組最高,但組間無明顯差異。2.2.2各組下降總率總骨含量隨劑量降低逐漸升高,10mg組最高,5mg組則開始下降,組間無明顯差異;皮質(zhì)骨含量10mg組最高,但組間無明顯差異;松質(zhì)骨含量呈劑量依賴性下降,40mg組最高,5mg組與其他組相較差異顯著。總骨密度10mg組最高,5mg組最低,5mg組與10、40mg組差異顯著;松質(zhì)骨密度隨劑量降低逐漸升高,5mg組開始下降,各組間無明顯差異;皮質(zhì)骨密度組間幾近相等,無明顯差異。骨總面積10mg組最高,組間無明顯差異;松質(zhì)骨面積5mg組最低,40mg組最高,5mg組與其他組相較差異顯著;皮質(zhì)骨面積5mg組最低,40mg組最高,各組間無差異。模擬壓縮強(qiáng)度10mg組最高,各組間無差異。2.2.3對(duì)比兩組患者的治療前后10個(gè)月基線組松質(zhì)骨含量和皮質(zhì)骨面積低于對(duì)照組,其余指標(biāo)皆大于對(duì)照組,但組間無明顯差異。綜上所述,10mg劑量組在多數(shù)指標(biāo)中優(yōu)于其他劑量組,但同對(duì)照組相比較并沒有明顯改善骨的密度及結(jié)構(gòu),基線組多數(shù)指標(biāo)均好于對(duì)照組。2.3礦化沉積量d大鼠處死前兩次腹腔注射鹽酸四環(huán)素,間隔時(shí)間10d,雙線間距離表示礦化沉積量,除以間隔時(shí)間即礦化沉積率。結(jié)果顯示,對(duì)照組礦化沉積率最高,10mg組略好于其他劑量組,但各組間無明顯差異(見表1)。2.4生物力學(xué)考試見表22.4.1剛度和彈性模量值負(fù)荷值對(duì)照組低于10mg組,且與5mg組差異顯著;應(yīng)力值對(duì)照組低于10、40mg組,但組間無差異;剛度和彈性模量值對(duì)照組最低,與5mg組差異顯著;能量與強(qiáng)度值對(duì)照組低于20mg組,其中,能量對(duì)照組與5mg組差異顯著,其余組間無明顯差異。2.4.2劑量對(duì)應(yīng)力值、剛度和彈性模量的影響負(fù)荷值隨劑量降低逐漸升高,5mg組開始下降,5mg組10、20、40mg組間差異顯著;應(yīng)力值隨劑量增加呈升高趨勢(shì),但組間無差異;剛度隨劑量降低呈升高趨勢(shì),但組間無差異;彈性模量隨劑量增加呈升高趨勢(shì),5mg組與10、40mg組差異顯著;能量與強(qiáng)度值20mg組最高,但組間無差異。2.4.3對(duì)照組vs根據(jù)地組基線組負(fù)荷和應(yīng)力值低于對(duì)照組,其余指標(biāo)皆高于對(duì)照組;其中,負(fù)荷基線組與對(duì)照組差異顯著,其余組間則無明顯差異。3討論3.1增齡性骨丟失模型大鼠的生命周期一般為3～4年,6月齡以后,股骨BMD與鈣的變化已極小,到12月齡時(shí)各項(xiàng)骨參數(shù)均已達(dá)平臺(tái)水平,隨后骨密度開始降低,但比較緩慢。Wang等認(rèn)為,9月齡時(shí)雄性SD大鼠骨骼已完全成熟,與增齡相關(guān)的骨丟失從此刻即已發(fā)生;這一過程與男性骨質(zhì)疏松類似,故推薦超過9月齡的雄性SD大鼠即可作為增齡性骨丟失模型。Banu等和Ke等在相關(guān)試驗(yàn)中亦證明9月齡以上雄性SD大鼠是有效的增齡模型。因此,本試驗(yàn)選擇15月齡大鼠作為增齡模型是有效的。人與動(dòng)物對(duì)同一藥物的耐受性的差別是很大的;一般說來,動(dòng)物的耐受性要比人大,即單位體重的用藥量動(dòng)物比人要大。可按下列比例換算:人用藥量為1,小白鼠、大白鼠為25～50,兔、豚鼠為15～20,狗、貓為5～10。目前,口服辛伐他汀的臨床安全極限用量是80mg/d,常用劑量是10、20和40mg/d,根據(jù)上述比例及Illingworth等就他汀類藥物的臨床毒性試驗(yàn)和等效分析的報(bào)告,按60kg的成人標(biāo)準(zhǔn)體重計(jì)算,本試驗(yàn)將口服劑量分為5、10、20和40mg·(kg·d)-1作為大鼠的灌胃劑量,在安全范圍內(nèi)已完全能夠覆蓋人體臨床常用劑量。因此,本試驗(yàn)辛伐他汀用藥量的選擇具有安全性和臨床可比性,可為臨床用藥提供一定的參考。3.2辛伐他汀對(duì)骨的治療反應(yīng)和礦化沉積率DXA主要用于整體骨密度的測(cè)定,能夠快速地形成對(duì)所測(cè)標(biāo)本的宏觀印象,多為骨骼定量分析的初步檢測(cè)方法。本試驗(yàn)結(jié)果提示,增齡大鼠腰椎的骨密度隨劑量減小出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),其中10mg組最高,但劑量組骨密度皆略低于對(duì)照組,且無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。pQCT能夠準(zhǔn)確地區(qū)分皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨,對(duì)觀察骨骼對(duì)藥物治療的反應(yīng)較DXA更敏感,利于了解藥物干預(yù)后不同骨骼成分的反應(yīng)?；€組多數(shù)指標(biāo)好于對(duì)照組,提示隨著增齡骨量有逐漸丟失的趨勢(shì)。各個(gè)劑量組同對(duì)照組相比較差異不明顯,10mg組雖在多數(shù)指標(biāo)中優(yōu)于其他劑量組和對(duì)照組,但沒有顯著差異。說明辛伐他汀并沒有明顯改善骨的密度及結(jié)構(gòu),這同DXA試驗(yàn)所得的結(jié)果相吻合。礦化沉積率可直接反映骨的礦化沉積速率,還可間接反映類骨質(zhì)的生成量,這是pQCT所無法檢測(cè)的。Wang等報(bào)告,在增齡SD大鼠模型中,腰L4椎體的變化比較明顯,故本文測(cè)定了腰L4椎體的礦化速率。結(jié)果顯示,各個(gè)劑量組同對(duì)照組相比較無明顯差異;雖10mg組略好于其他劑量組,但各組間仍無明顯差異。綜合DXA、pQCT和礦化沉積率的測(cè)定結(jié)果,從骨的結(jié)構(gòu)和骨的重建兩方面表明,辛伐他汀并沒有促進(jìn)增齡模型的椎體內(nèi)成骨。然而,衡量骨骼的變化和反映骨骼質(zhì)量的最終指標(biāo)是骨骼的生物力學(xué)性能,必須以生物力學(xué)分析作為最終檢測(cè)和評(píng)價(jià)手段,才能夠得出較為確切的結(jié)果。3.3骨力學(xué)強(qiáng)度分析數(shù)年的研究和臨床資料總結(jié)發(fā)現(xiàn),骨密度測(cè)量?jī)H可以代表60%～80%的骨力學(xué)強(qiáng)度,其對(duì)骨質(zhì)疏松療效的預(yù)測(cè)正確率不超過70%;若再同時(shí)進(jìn)行骨力學(xué)強(qiáng)度分析,則可使預(yù)測(cè)正確率提高20%。防止骨質(zhì)疏松的最終目的就是要提高骨的生物力學(xué)性能,故從生物力學(xué)角度分析骨骼強(qiáng)度就非常有必要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果