超分辨率顯微技術(shù)淺談

超分辨率顯微技術(shù)淺談?wù)?關(guān)鍵詞:正文：一：超分辨率技術(shù)的原理：即通過碩件或軟件的方法提高原有圖像的分辨率，通過一系列低分辨率的圖像來得到一幅高分辨率的圖像過程就是超分辨率旋建。超分辨率重建的核心思想就是用時(shí)間帶寬（獲取同一場景的多幀圖像序列）換取空間分辨率,實(shí)現(xiàn)時(shí)間分辨率向空間分辨率的轉(zhuǎn)換。二：超分辨率顯微技術(shù)產(chǎn)生原因：傳統(tǒng)比學(xué)顯微鏡受限于光的波長，無法對(duì)200nm以下的物體進(jìn)行觀測。電子顯微鏡雖然町以達(dá)到納米級(jí)的分辨率，但通電的結(jié)果容易造成樣品的破壞，I月此能觀測的樣本也相當(dāng)有限。蛋白質(zhì)貼上熒光卷標(biāo)得技術(shù)雖然已經(jīng)較為成熟，但因?yàn)榈鞍踪|(zhì)人分子的理化特性使其容易堆枳，很難在顯微鏡卜誠行觀察。因此急需一種可以對(duì)200一一750nm大小范闈內(nèi)的物體進(jìn)行觀察并且擁有較高的空間分辨率（20nm以下）的顯微鏡。三：三種顯微技術(shù)的研究：超近場光學(xué)掃描（UNFOS）：超分辨率熒光顯微技術(shù)（xy平而上的改進(jìn)）：熒光顯微鏡和熒光顯微技術(shù)：熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由）t源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放人以觀察標(biāo)本的熒光圖像。熒光顯微技術(shù)是應(yīng)用短波光照射被測物質(zhì)以激發(fā)其發(fā)射熒光從而在熒光顯微鏡卜觀察。單分子熒光成像：當(dāng)顯微鏡需要分辨兩個(gè)或者更多點(diǎn)光源的時(shí)候，很難突破光學(xué)分辨率的極限來進(jìn)行精確定位。而當(dāng)顯微鏡的物鏡視野下僅有單個(gè)熒光分子的時(shí)候，通過特定的算法擬合，此熒光分子位置的精度町以很容易超過光學(xué)分辨率的極限，達(dá)到納米級(jí)。在同樣的信噪比圖像上，用高斯函數(shù)擬含單分子熒光的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)町以達(dá)到最佳的定位精度.Thompson等科學(xué)家結(jié)合了理論推導(dǎo)和計(jì)算機(jī)模擬，綜合考慮了各種因素的影響，如離散時(shí)間段檢測到的發(fā)岀光子數(shù)的泊松噪聲、CCD相機(jī)的背景讀出噪聲以及CCD像素點(diǎn)的大小等，得到了單分子在二維定位持度上的近似公式:其中單分子在二維定位持度上的近似公式:其中X為定位的誤差，s為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方差，a為CCD像素的人小，N為收集到的光子數(shù)，b為背景噪聲。PALM和STORM：盡管單分子的定位精度可以達(dá)到納米級(jí)，但它并不能提高光學(xué)顯微鏡在分辨兩個(gè)或者多個(gè)點(diǎn)光源時(shí)的分辨率。2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz等在Science匕提出了光激活定位顯微技術(shù)（photoactivatedlocalizahonmia'oscopy,PALM）:是用PA-GFP來標(biāo)記蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié)405run激光器的能量，低能量照射細(xì)胞表面，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個(gè)熒光分子，然后用488nm激光照射,通過高斯擬介來精確定位這些熒光單分子.在確定這些分子的位置后，再長時(shí)間使用488nm激光照射來漂白這些已經(jīng)定位止確的熒光分子，使它們不能夠被卜?一輪的激）t再激活出來.Z后，分別用405nm和488nm激光來激活和漂白其他的熒光分子，進(jìn)入下一次循環(huán).這個(gè)循環(huán)持續(xù)上百次后，我們將得到細(xì)胞內(nèi)所有熒光分子的精確定位.將這些分子的圖像合成到一張圖卜?，域后得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上分辨率的顯微技術(shù)，如圖所示，PALM顯微鏡的分辨率僅僅受限丁單分子成像的定位精度,理論上來說町以達(dá)到lnm的數(shù)量級(jí)。理論上來說町以達(dá)到lnm的數(shù)量級(jí)。PALM的成像方法只能用來觀察外源表達(dá)的蛋口質(zhì)，而對(duì)于分辨細(xì)胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位無能為力.2006年底，美國霍華德?休斯研究所的華裔科學(xué)家圧曉薇實(shí)驗(yàn)組開發(fā)出來一種類似于PALM的方法，町以用來研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白的超分辨率定位：隨機(jī)比學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)（stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM）:.將Cy3和Cy5分子對(duì)膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來標(biāo)記細(xì)胞的內(nèi)源蛋白?應(yīng)用特定波長的激光來激活探針，然后應(yīng)用另一個(gè)波長激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子，此過程循壞上百次后就町以得到報(bào)后的內(nèi)源蛋白的高分辨率影像。dSTED（受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)）：用一束激發(fā)光使熒光物質(zhì)（既可以是化學(xué)介成的染料也町以是熒光蛋白）發(fā)光的同時(shí)，用另外的高能最脈沖激光器發(fā)射一束緊挨著的、環(huán)型的、波長較長的激光將第一束光斑中人部分的熒光物質(zhì)通過受激發(fā)射損耗過程猝滅，從而減少熒光光點(diǎn)的衍射面積，顯著地提高了顯微鏡的分辨率.— STED成像技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是可以快速地觀察活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)變化的過程，因此在生命科學(xué)中應(yīng)用更加廣泛e.SSIM（飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)）：將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息。掃描隧道顯微鏡：a.弱點(diǎn)：⑴.對(duì)觀察樣晶限制較多，例如樣胡必須是導(dǎo)體，不能是非導(dǎo)體和溶液等；（2）.對(duì)樣品壞境令嚴(yán)格要求，如要求高真空等：（3）.對(duì)觀察的對(duì)象都過多過少造成損害，而光學(xué)顯微鏡對(duì)樣品的限制極少，可以是非導(dǎo)體或液體，可以是有生命的也可以實(shí)物主命的，可以是透明的也町以是不透明茯至發(fā)光的，不僅可以觀察處于靜態(tài)的樣品還町以觀察動(dòng)態(tài)情況卜的樣品。至于樣品環(huán)境更無特殊要求，町以使常溫人'（壓，也町以是非常溫和非常壓的環(huán)境，觀察對(duì)物體不造成損傷則更是光學(xué)顯微鏡的一大b.打描隧道顯微鏡的工作原理：打描隧道顯微鏡就是根據(jù)最子力學(xué)中的隧道效應(yīng)與原理，通過探測固體表面原子中的電子的隧道電流來分辨表面形貌的顯微裝置。根據(jù)量子理論，由于電子的隧道效應(yīng)，金加中的電子并不完全局限于金屬表面之內(nèi)，電子云密度并不是在表面邊界處突變?yōu)榱恪Ｔ诮饘俦矶酝?，電子云密度呈指?shù)衰減，衰減長度約為lnm用一個(gè)極細(xì)的、只有原子線度的金屬針尖作為探針，將它與被研究物質(zhì)（樣品）的表面作為兩個(gè)電極，當(dāng)樣品表面與針尖非常靠近（距離（lnm）時(shí)，兩者的電子云略有重疊，若在兩極間加上電壓Vb,在電場作用卜?電子就會(huì)穿過兩個(gè)電極之間的勢壘，通過電子云的狹窄通道流動(dòng)，從一極流向另一極，形成隧道電流I。隧道電流I的大小與針尖和樣品間的距離S以及樣品表面平均勢壘的高度有關(guān)。關(guān)系式為：類似于隱失波在界面匕的衰減.高分辨率止是因?yàn)檫@種指數(shù)衰減對(duì)距離的敏