瓜子金有效部位群抗炎作用機(jī)制的體外研究

瓜子金有效部位群抗炎作用機(jī)制的體外研究

瓜金是科的一種無(wú)性系植物，不同于小型遠(yuǎn)志、地藤草和銀杏葉。這是科維科。瓜子金最早見(jiàn)載于《植物名實(shí)圖考》,曾被1977年版《中國(guó)藥典》收載,全草入藥,具有祛痰止咳、寧心安神、散血止瘀的作用,主治咳嗽痰多、咽喉腫痛、心悸失眠、癰腫瘡瘍等癥。河南伏牛山地區(qū)民間用其治療肺結(jié)核、咽喉腫痛、無(wú)名癤腫、食道癌、呼吸道炎癥、毒蛇咬傷等疾病,均有良好的療效。研究資料顯示瓜子金體內(nèi)給藥具有顯著的抗炎活性。本試驗(yàn)室前期研究中采用大孔吸附樹(shù)脂純化技術(shù)獲得以總黃酮、總皂苷為主要成分的有效部位群(總黃酮、總皂苷含量達(dá)77%以上),本文利用體外炎癥模型對(duì)瓜子金有效部位群抗炎機(jī)制進(jìn)行初步的研究。1材料表面1.1母株參數(shù)264。71.2藥物和試劑1.3基因擴(kuò)增儀器多元定量PCR儀(美國(guó)MJRESEARCH公司);多功能熒光酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);EDC-810基因擴(kuò)增儀(東盛創(chuàng)新生物科技有限公司);BS110S分析天平(德國(guó)Sartorius公司);Napco5410型二氧化碳孵箱,美國(guó)NAPCO公司;BCN-1360型超凈工作臺(tái),北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;XDS-1B倒置顯微鏡,重慶光電儀器公司。2方法2.1家蠶的培養(yǎng)和處理RAW264.7細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清100U·mL-1青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。2.2mtt法測(cè)瓜子金的存活率RAW264.7細(xì)胞按2×105/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24h后,棄上清,分別加入質(zhì)量濃度為100,50,20,10,1mg·L-1的瓜子金有效部位群,每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h,每孔加入MTT(5g·L-1,PBS配制)20μL,繼續(xù)孵育4h,棄去上清,每孔加入150μLDMSO,震蕩10min,于492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用以存活率表示,存活率越高,表明藥物毒性越低。存活率計(jì)算公式如下:2.3基于lps的瓜子金形細(xì)胞的刺激細(xì)胞懸液以每孔1×105/100μL接種于96孔板,培養(yǎng)24h?？瞻捉M采用含0.1%DMSO的RMPI1640培養(yǎng)細(xì)胞,模型組采用LPS(1mg·L-1)刺激細(xì)胞,瓜子金有效部位群組采用10,20,50mg·L-13個(gè)劑量處理細(xì)胞。各組分別刺激24,48h后,吸取96孔板中的培養(yǎng)液100μL到另一96孔板中,加入等體積的Griessreactin試劑,室溫放置10min,用酶標(biāo)儀讀取540nm處A,計(jì)算瓜子金有效部位群各劑量組在不同處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞上清液中亞硝酸鹽抑制率。2.4瓜子金細(xì)胞tnf-和il-6含量檢測(cè)將RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組,LPS刺激組和瓜子金有效部位群組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,正常對(duì)照組用RPMI1640完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng);LPS刺激組加入LPS使終濃度為1mg·L-1;瓜子金有效部位群組加入藥物使終濃度為50mg·L-1,同時(shí)加入終濃度為1mg·L-1的LPS。37℃5%CO2孵育12h,收集上清液,用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6含量。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2.5pcr檢測(cè)cd細(xì)胞的培養(yǎng)與分組同2.4。分組后分別加入藥物和LPS刺激2,4,8,12h,收集細(xì)胞,加入1mLTrizol裂解,按說(shuō)明書(shū)方法提取總RNA。按總RNA12μL,5×RTBuffer4μL,2.5mmol·L-1dNTP混合液2μL,100U·μL-1RTAce1μL比例配制混合液,混合液在PCR分析儀中按如下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄:30℃10min,42℃40min,85℃5min,4℃5min,獲得cDNA。按RealtimePCRMasterMix12.5μL,三蒸水11.0μL,引物0.25μL,cDNA模板1.0μL配制Real-timePCR反應(yīng)液,反應(yīng)液置Real-timePCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng),以GAPDH為內(nèi)參照,根據(jù)C(t)值計(jì)算TNF-α和IL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)量。2.6統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS11.5軟件,統(tǒng)計(jì)分析采用方差分析,結(jié)果用表示,P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1兩組患者的致突變性對(duì)比結(jié)果表明,瓜子金有效部位群質(zhì)量濃度為100mg·L-1時(shí)細(xì)胞存活率低于正常對(duì)照組,與正常對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01);藥物質(zhì)量濃度在1~50mg·L-1各給藥組與正常對(duì)照組比較,細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異,說(shuō)明瓜子金有效部位群在1~50mg·L-1無(wú)明顯細(xì)胞毒性。3.2瓜金有效異組對(duì)細(xì)胞中的no生成的影響3.3兩組il-6含量比較如表2所示,空白對(duì)照組僅有少量TNF-α和IL-6表達(dá),LPS刺激組TNF-α,IL-6含量明顯增加(P<0.01);瓜子金有效部位群組與LPS刺激組相比,TNF-α和IL-6蛋白的含量明顯減少(P<0.01),說(shuō)明瓜子金有效部位群可顯著抑制TNF-α和IL-6的表達(dá)。3.4瓜子金有效部位的tnf-和il-6mrna的相對(duì)表達(dá)RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后,TNF-α和IL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)量在不同的時(shí)間點(diǎn)均顯著增加,其中TNF-αmRNA在2h時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高,IL-6mRNA在8h時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高;與LPS刺激組相比,瓜子金有效部位群組在各時(shí)間段TNF-α和IL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P<0.01或P<0.05)。如圖1~2所示。4瓜子金有效部位群的抗炎作用巨噬細(xì)胞是炎癥過(guò)程的重要效應(yīng)細(xì)胞,廣泛參與機(jī)體的炎癥反應(yīng),當(dāng)受某些因素激活后會(huì)產(chǎn)生大量的NO和TNF-α,并進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。脂多糖(LPS)為炎癥刺激物,可激活巨噬細(xì)胞,促使NO、氧自由基、胞因子、趨化因子、細(xì)前列腺素等的表達(dá),加劇炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)針對(duì)瓜子金有效部位群對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO,TNF-α及IL-6等炎癥因子的影響進(jìn)行了研究,結(jié)果表明瓜子金有效部位群能顯著抑制NO,TNF-α及IL-6的生成與釋放,能顯著降低TNF-α和IL-6mRNA的表達(dá)。由此可以推測(cè)瓜子金有效部位群可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO,TNF-α及IL-6等炎癥因子來(lái)發(fā)揮抗炎作用。本試驗(yàn)室前期研究中已采用現(xiàn)代大孔吸附樹(shù)脂純化技術(shù)獲得瓜子金有效部位群(總黃酮、總皂苷含量達(dá)77%以上),本研究是在前期研究的基礎(chǔ)上,對(duì)瓜子金有效部位群抗炎的作用機(jī)制進(jìn)行探討,以期為其二次開(kāi)發(fā)出物質(zhì)基礎(chǔ)明確、作用機(jī)制清楚的現(xiàn)代中藥制劑提供科學(xué)依據(jù)。購(gòu)于武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。瓜子金有效部位群,秋季成熟時(shí)采集瓜子金全草,洗凈,曬干,70%乙醇提取,大孔吸附樹(shù)脂純化后噴霧干燥,其中總黃酮、總皂苷含量達(dá)77%以上(其中總黃酮含量不低于33%,總皂苷含量不低于44%);試驗(yàn)時(shí)用二甲基亞砜及無(wú)水乙醇(1∶9)溶解,配成實(shí)驗(yàn)所需濃度。脂多糖(LPS,011B4),Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基,Invitrogen公司;胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司;TrizolReagent,Invitrogen公司;人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒,美國(guó)R&D公司;其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。存活率=(藥物干預(yù)孔A-空白對(duì)照孔A)/(正常細(xì)胞孔A-空白對(duì)照孔A)×100%抑制