第二節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

第二節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

Polymerasechainreaction

PCRContentofTable一、PCR的定義二、PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)三、PCR原理四、PCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系五、PCR反應(yīng)五要素六、PCR類型及應(yīng)用一、PCR的定義在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定克隆或基因組DNA序列進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。PCR技術(shù)的創(chuàng)建Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。KaryB.Mullis（1944－）二、PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍三、PCR原理Sample1.denaturatation2.Primerannealing3.PrimerextensionRegiontobecopiedPCR技術(shù)原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。模板DNA變性：加熱至94℃左右，雙鏈DNA解離成單鏈；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP為原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的雙鏈；重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增PCRproductTargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cyc