植物組織石蠟切片的制作

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握石蠟切片制作的基本過程及其注意事項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)材料和儀器

實(shí)驗(yàn)材料:植物材料、石蠟、酒精、二甲苯、番紅/固綠染色液等；實(shí)驗(yàn)儀器和器皿：石蠟切片機(jī)、展片機(jī)、染色缸、載玻片、蓋玻片等。石蠟制片的基本步驟1.取材2.固定、保存3.脫水4.透明5.浸蠟與包埋6.切片7.粘片與烤片8.脫蠟與復(fù)水9.染色10.切片脫水、透明和封固1.取材1.1材料來源及部位：與觀察目的有關(guān)①種類②部位③發(fā)育階段④觀察橫切面還是縱切面？1.2取材原則：動(dòng)作：快，輕，用力均勻體積合適（5-10mm為宜）刀要鋒利2.固定、保存目的---殺死各種酶，保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)固定液固定時(shí)間固定后的處理最常用的固定液為FAA。固定時(shí)間不受限制，短則數(shù)小時(shí)，長可延至數(shù)月或數(shù)年。配方：

50％或70％酒精90毫升

冰醋酸5毫升

福爾馬林5毫升

柔軟材料用50％酒精，堅(jiān)硬材料用70％酒精配制?？ㄖZ氏(Carnoy’s)固定液：有極強(qiáng)的滲透力固定根尖和花藥只需40-60分鐘，時(shí)間太長不好(不能超一天)。固定后用95％酒精沖洗，在組織不能立即處理時(shí)，需轉(zhuǎn)入70％酒精中保存。配法有兩種：固定組織時(shí)應(yīng)注意：①保持組織新鮮，勿使其干燥，盡快固定處理。②組織塊不易過大過厚，厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)。③固定液必須有足夠的量，一般大于組織20倍以上。④抽氣：使固定液盡快滲入材料內(nèi)部，并排除材料內(nèi)氣泡的干擾。組織固定后的處理①?zèng)_洗或漂洗：組織固定后應(yīng)充分水洗，除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會(huì)影響以后的染色效果。②材料經(jīng)過固定后，需要保存下來以備利用，通常使用的保存劑是70%的酒精溶液，可以使一般的材料保存較長的時(shí)間而不至于變壞。（FAA或卡諾固定液固定不需要沖洗）③通常在冰箱中4℃存放。3.脫水水和透明劑不能互溶，只有脫去水分后，才能讓透明劑進(jìn)入。凡用酒精配制的固定液，一律用同濃度的酒清洗。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混。為了避免組織材料的急劇收縮，應(yīng)按從低濃度到高濃度遞增的順序進(jìn)行.30%--50%---70%---85%---95%--100%---100%每步30-60分鐘左右。要求及注意事項(xiàng)保證脫水梯度和每一步脫水時(shí)間，水要完全脫凈。不同大小的組織塊脫水時(shí)間不同。不能過度脫水（過久使組織變脆、收縮）材料可以放在70％酒精中保存。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環(huán)等也可做脫水劑。4.透明純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明.常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。通常組織先經(jīng)純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1～2小時(shí)，再轉(zhuǎn)入純透明劑中浸漬。材料進(jìn)入無水的透明劑中后，若透明劑變渾濁，說明材料中的水分未脫干凈，必須回到前面一級(jí)無水的脫水劑中再次脫水（但是效果往往不好）。透明劑的浸漬時(shí)間則要根據(jù)組織材料塊大小及組織特性而定。5.浸蠟與包埋用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時(shí)或者過夜，再先后移入熔化的石蠟液中浸漬幾天。浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)3℃左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。石蠟熔點(diǎn)：45-50℃軟蠟55-60℃硬蠟材料較硬的，用熔點(diǎn)較高的石蠟包埋；切片較薄時(shí)（在8微米以下），用熔點(diǎn)較高的石蠟包埋；夏季采用熔點(diǎn)較高的石蠟（56,58）,冬季宜選用熔點(diǎn)較低的石蠟（52,54）。石蠟的處理：新蠟應(yīng)溶一次，增加密度。并用濾紙過濾去除雜質(zhì)。加5%～10%的蜂蠟(工蜂腹部下面四對(duì)蠟腺分泌物質(zhì)

),增加石蠟的韌性。反復(fù)溶的舊蠟包埋效果更好。程序：在溶蠟箱中進(jìn)行，55-60℃，恒溫。浸蠟：二甲苯透明后的組織塊在二甲苯︰石蠟（1︰1）中1次，在石蠟中2次，每次1-3天左右。包埋：在室溫進(jìn)行6.切片包埋好的蠟塊用刀片修