園藝植物的生物技術(shù)研究完整版

園藝植物研究法園藝植物的生物技術(shù)研究生物技術(shù)?

以滿足人類不同層次生活需求為目的的對(duì)生命活

動(dòng)形式的研究、探索、改造、利用的所有相關(guān)技

術(shù)都屬于生物技術(shù)的范疇。?

生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)特征：高投入、高效益、短周期

?

生物技術(shù)的主要類型：細(xì)胞工程、基因工程、酶工程、發(fā)酵工程、代謝工程細(xì)胞工程應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，在細(xì)胞

水平進(jìn)行的遺傳操作。包括快繁、脫毒、細(xì)胞

培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)及融合等

組織培養(yǎng)成功的植物已超過600種；

花藥培養(yǎng)再生的植物超過200種；

原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的植物超過100種基因工程人類按照設(shè)計(jì)，將某種生物的基因分離出來，

借助基因重組技術(shù)與載體分子組成重組DNA，

或采用直接導(dǎo)入的技術(shù)，將目的基因引入受

體細(xì)胞，使后者迅速、定向地獲得新的遺傳

性狀或成為一種新型的生物物（品）種分為動(dòng)物基因工程、植物基因工程、微生物

基因工程和病毒基因工程二、園藝植物生物技術(shù)研究園藝植物生物技術(shù)的種類、應(yīng)用和

研究方法。提綱2.1

園藝植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用2.2

原生質(zhì)體培養(yǎng)、再生、融合技術(shù)

2.3

分子標(biāo)記的應(yīng)用2.4

基因工程2.1

園藝植物組織培養(yǎng)?

在離體條件下，使園藝植物的

某一器官、組織或細(xì)胞增殖和

再生的技術(shù)。?

這一技術(shù)的理論基礎(chǔ)是植物細(xì)

胞的全能性假說。植物細(xì)胞的全能性假說/植物組織培養(yǎng)的要素外植體無菌操作培養(yǎng)基誘導(dǎo)、培養(yǎng)、再生條件植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1、實(shí)驗(yàn)室建設(shè)2、培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)基配制3、接種所用的材料與材料的接種方法

4、激素的使用與培養(yǎng)物的再生5、試管苗的生根與移栽實(shí)驗(yàn)室建設(shè)?

實(shí)驗(yàn)室：培養(yǎng)基準(zhǔn)備室、接種室、培養(yǎng)室、觀

察分析室。?

設(shè)備：滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、天平和顯微鏡。

?

要求：接種室和超凈工作臺(tái)提供一個(gè)無菌的條件。培養(yǎng)室要求溫度恒定，一般是25－28℃，

光照時(shí)數(shù)和強(qiáng)度可控。培養(yǎng)基的選擇及配制?

培養(yǎng)基：為外植體生長(zhǎng)提供碳素營(yíng)養(yǎng)、水份、

礦質(zhì)元素、激素、維生素及其它有機(jī)營(yíng)養(yǎng)的介

質(zhì)。按狀態(tài)分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基兩類。?

激素的使用：培養(yǎng)基中常常要加入植物（外源）

激素才能使外植體產(chǎn)生愈傷組織或啟動(dòng)分裂。培養(yǎng)基的主要成分及種類

大量元素：N、P、K、Mg、Ca、Fe（與EDTA螯合）

微量元素：I、Cu、Mo、Zn、CoB族維生素、維生素C、甘氨酸、肌醇、激素培養(yǎng)基的配制1)母液配制?

N、P、K、Mg、Ca鹽按順序配在一起，濃度為使用時(shí)的10倍?

Fe鹽常與EDTA（乙二胺四乙酸鈉）配在一起，配成100倍母液

?

微量元素（I、Cu、Mo、Zn、Co）、B族維生素、維生素C、甘氨酸、肌醇分別配成100倍。2)激素類根據(jù)使用濃度，可配成100倍左右的母液。3)

母液保存在4℃冰箱中，可使用1-2個(gè)月。4)園藝植物常用的基本培養(yǎng)基：MS，Murashige和Skoog于1962

年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)，適用于蔬菜、花卉的組織培養(yǎng)；

MT，

適用于柑橘的組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基的配制5）使用前，取母液稀釋、加入蔗糖，定容后測(cè)定pH值。

pH值在5.8-6.0之間；<

5.8，固體培養(yǎng)基偏軟；>

6.0，固體培養(yǎng)基偏硬。?

過酸或過堿時(shí)，分別用1N

NaOH或1N

HCl調(diào)至所需的值?

培養(yǎng)基配成固體時(shí)，應(yīng)加入0.6~1.0％的瓊脂如配置液體培養(yǎng)基，則不需加入瓊脂?

pH值調(diào)整好后直接分裝，，高壓濕熱滅菌，1.05kg/cm2，

120℃，15-20min滅菌?

培養(yǎng)基常溫放置幾天確保無菌后，再使用??材料的接種外植體：組培過程中所使用的材料稱為外植體－Explant

消毒－－采用理化方法殺滅微生物的方法。外植體的消毒：必須經(jīng)過表面消毒將微生物殺死后才能接種。

否則造成污染。先將材料用自來水洗凈，在75%的酒精

中浸30秒鐘左右，轉(zhuǎn)入5－15%的次氯酸鈉中浸泡5－10

分鐘，最后用消毒后的蒸餾水洗滌材料3－5次。?

消毒后的材料，根據(jù)需要，用滅過菌的器械將其分離或切

割，然后接入到培養(yǎng)基中。激素的類型作用：使外植體產(chǎn)生愈傷組織或啟動(dòng)分裂??生長(zhǎng)素類（Auxins）：NAA（萘乙酸）、2,4-D（2,4-二氯

苯氧乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）等

細(xì)胞分裂素（CTK）：常用的是6-BA（6-芐基腺嘌呤）、KT（激動(dòng)素）、ZT（玉米素）等?赤霉素：較少應(yīng)用，促進(jìn)試管苗的生長(zhǎng)。細(xì)菌過濾器消毒：

經(jīng)過一層微孔濾膜（0.22~0.45

μm)。

微生物不能通過濾膜。用于酶液和激素的消毒。激素的比例?

生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素對(duì)形態(tài)分化極其重要比例高時(shí)有利于生根----生根培養(yǎng)基比例低時(shí)有利于芽的分化----生芽培養(yǎng)基比例處于平衡時(shí)有利于愈傷組織的生長(zhǎng)----基本培養(yǎng)基

因物種不同，激素的絕對(duì)比例有所不同。e.g.柑橘2,4-D

1.5

+

NAA

1.0

+

KT

0.15

+

ZT

0.10(mg/L)－－愈傷及愈傷繼代

KT

0.5

+

6-BA

0.5

+

NAA

0.1(mg/L)－－分化芽NAA

1.0(mg/L)－－分化根培養(yǎng)物再生成植株的方式

1.

胚狀體途徑：培養(yǎng)物先產(chǎn)生愈傷組織，然后產(chǎn)生類似于胚的結(jié)構(gòu)（胚狀體）。或直接產(chǎn)生胚狀體。后者能象

種子那樣萌發(fā)成苗，產(chǎn)生的量大，再生植株的變

異較小。柑橘的胚狀體是由單細(xì)胞起源，產(chǎn)生嵌

合體的機(jī)會(huì)少，在快繁及遺傳育種中有具有重要

的價(jià)值。2.

器官發(fā)生途徑：先分化出莖芽，然后再形成根成

為完整植株。

愈傷組織(callus)產(chǎn)生芽時(shí)，一般是多細(xì)胞起源，容易產(chǎn)生嵌合體和變異(變異篩選)芽苗的生根?

園藝植物組培時(shí)常得到無根的芽苗（叢芽），移栽

前必須誘導(dǎo)生根。?

誘導(dǎo)生根方式：（1）降低培養(yǎng)基鹽濃度；（2）配合使用生長(zhǎng)素IBA、NAA等；（3）添加吸附劑，如活性炭（4）可采用試管嫁接的方法使其成為完整植株。傷口愈合

長(zhǎng)出新葉時(shí)，可移栽。移栽和煉苗?

組培苗從半自養(yǎng)到全自養(yǎng)的適應(yīng)過程?

移栽前加強(qiáng)光照，使幼苗充實(shí)和木質(zhì)化?

或?qū)⑴囵B(yǎng)基中糖的濃度降低，減少無機(jī)鹽濃度?

經(jīng)過2周左右，將試管蓋揭開，放在散射光下，

自然溫度（高溫和嚴(yán)冬除外）中鍛煉1~2周。園藝植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用

（一）快速繁殖和脫毒技術(shù)（二）為獲得倍性水平不同的材料而進(jìn)行的組織

培養(yǎng)――倍性育種（三）胚搶救（四）試管開花與花芽分化機(jī)理研究（五）提供選、育種新資源（一）快速繁殖和脫毒技術(shù)

快繁在短期內(nèi)，使園藝植物個(gè)體增殖到常規(guī)方法難

以達(dá)到的數(shù)量。它是將園藝植物的莖尖或其它

器官在人工培養(yǎng)基中使其快速增殖成許多植株

的過程。脫毒園藝植物生產(chǎn)中需要的不僅是優(yōu)良的種苗，而

且是無病毒的種苗。因此，人們往往在快速繁

殖的同時(shí)，結(jié)合了病毒脫除的程序。最后，繁

殖出來的是無病毒種苗。?

我國(guó)快速繁殖植物的種類達(dá)443種之多?

非洲紫羅蘭葉片扦插年繁殖3.4倍，而用組織

培養(yǎng)方法，年繁殖可達(dá)10萬倍以上?

康乃馨、月季、蘭花、牡丹、香石竹、唐菖蒲、

無籽西瓜、菠蘿、桉樹以及扦插難以成活的菊

花的名貴品種。?

香蕉、葡萄等工廠化育苗基地的建立，每年可

生產(chǎn)上萬株種苗，節(jié)省了土地資源和能源消耗。病毒脫除?

采用的莖尖大小有嚴(yán)格的要求。如柑橘莖尖的

大小應(yīng)控制在0.14~0.18mm為宜。這一范圍的

莖尖由于輸導(dǎo)組織還未分化，病毒未到達(dá)莖尖。?

柑橘的莖尖不易培養(yǎng)成植株，要采用莖尖微芽

嫁接方法（STG．Shoot-tip

grafting

）以獲

得無病毒苗?

在實(shí)際應(yīng)用時(shí)把熱處理、莖尖培養(yǎng)和微芽嫁接

技術(shù)結(jié)合起來，以提高脫毒的效率。病毒蛋白

質(zhì)外殼的轉(zhuǎn)基因技術(shù)也可以用于病毒脫除中。摸索添加激素的條件如，摸索細(xì)胞分裂素(6-BA)，與生長(zhǎng)素IAA、

IBA、NAA的濃度配合。方法1：第一步可將濃度梯度設(shè)得較大，如0，

2，4，6，8，10mg／L；第二步再將濃度細(xì)化。

方法2：可采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。方法3：根據(jù)前人的結(jié)果，進(jìn)行濃度的上下調(diào)

動(dòng)，或?qū)讉€(gè)最佳激素配比進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。摘要:

以猴耳環(huán)成熟的種胚無菌萌發(fā)小苗為外植體,

研究不同

種類及濃度的植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)叢芽誘導(dǎo)增殖和植株再生的影

響,

建立完整的離體快繁體系。結(jié)果表明,

猴耳環(huán)種胚最佳滅

菌方式為0.1%

HgCl2處理12

min,

污染率16.10%,

無菌萌發(fā)率

78.66%;

叢芽初代誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA

0.5

mg·L-1,

誘導(dǎo)

率100%;

繼代增殖最適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA

0.7

mg·L-1+NAA

0.05

mg·L-1+IBA

0.3

mg·L-1,

增殖系數(shù)3.95;

1/2MS+NAA

0.1

mg·L-1+活性炭0.1

g·L-1適合誘導(dǎo)生根,

45

d后可獲得健壯植株,

生根率100%,

平均根數(shù)4.41。將生長(zhǎng)良好的植株移栽到等體積

比蛭石、沙子、泥炭土混合的基質(zhì)中,

成活率66.67%。42

實(shí)驗(yàn)方法2.1

種子滅菌和無菌苗的獲得2.2

叢芽的誘導(dǎo)2.3

叢芽繼代與增殖：以MS為基本培養(yǎng)基,

采用L9

(3

)

正交表設(shè)計(jì)研究6-BA、NAA和IBA對(duì)猴耳環(huán)繼代增殖

培養(yǎng)的影響。培養(yǎng)45

d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、增殖系數(shù)和

平均芽高,

并觀察叢芽生長(zhǎng)情況。2.4

生根培養(yǎng)2.5

煉苗移栽正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)配比對(duì)猴耳環(huán)叢芽繼代增殖的影響：根

據(jù)R值的分析結(jié)果可知,

對(duì)增殖系數(shù)的影響6-BA>NAA>IBA,

其中6-BA對(duì)增殖系數(shù)具有顯著性影響,

而NAA和IBA為不顯

著因素。比較K值可得,

最優(yōu)組合為編號(hào)9

(MS+6-BA

0.7

mg·L-1+NAA

0.15

mg·L-1+IBA

0.2)草莓、甜櫻桃的快繁與脫毒（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)）?

病毒病危害果實(shí)品質(zhì)。?

草莓微莖尖分化成芽?

流程：莖尖培養(yǎng)、增殖繼代、生根、馴化移栽、

包裝馬鈴薯試管種快繁（二）組織培養(yǎng)－－倍性育種

花藥培養(yǎng)?

通過花藥培養(yǎng)，使花粉啟動(dòng)分裂并再生成植株，

再經(jīng)過加倍獲得純合二倍體，為育種研究提供

寶貴的材料，直接獲得優(yōu)良的品種。?

我國(guó)在四季橘、葡萄、蘋果等獲得花藥培養(yǎng)再

生植株。對(duì)柑橘花藥培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，一些長(zhǎng)

期有性繁殖的種類，如枳殼，其花藥在MT基本

培養(yǎng)基中就可再生。（三）胚搶救將發(fā)育不成熟的胚胎在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，

使其完成發(fā)育過程再生成植株。應(yīng)用：桃等核果類的早熟品種常遇到胚發(fā)育不完全的現(xiàn)象。

許多柑橘品種雜交之后，因珠心胚干擾使得雜種胚

發(fā)育不良或早夭。由遺傳因素引起的胚敗育，如遠(yuǎn)緣雜交無核葡萄品種作母本雜交時(shí)常遇到胚敗育問題研究成果：?

30年代我國(guó)銀杏的胚離體培養(yǎng)，?

1974年北京市農(nóng)林科學(xué)研究院將早生水蜜桃×橘

早生的雜種幼胚培養(yǎng)，獲得了桃京早3號(hào)；?

1975年中國(guó)農(nóng)科院柑橘研究所進(jìn)行柑橘胚分離培

養(yǎng)，已獲得雜種苗。?

意大利Starrantino等人利用二倍體作母本，與四

倍體雜交，通過胚胎搶救技術(shù)成功地獲得了三倍

體柑橘植株，其中有具商業(yè)價(jià)值的品系。2.2

原生質(zhì)體培養(yǎng)、再生、融合技術(shù)?

原生質(zhì)體（Protoplast)：是指去除細(xì)胞壁的

被原生質(zhì)膜包圍的“裸露細(xì)胞”，是進(jìn)行基礎(chǔ)

研究和品種改良的理想材料。容易接受外來因

素如化學(xué)誘變劑等的刺激，并可以攝取外源遺

傳物質(zhì)，如DNA分子、質(zhì)粒等。?

原生質(zhì)體培養(yǎng)的再生過程：原生質(zhì)體分離－純

化－培養(yǎng)－再生胚狀體（或莖芽）－萌發(fā)（或

生根）成株園藝植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的成就

1975年柑橘原生質(zhì)體培養(yǎng)成功現(xiàn)有蘋果、梨、櫻桃、獼猴桃、柿、枇杷、

草莓、西番蓮等木本植物中柑橘最為成功馬鈴薯、番茄、矮牽牛等原生質(zhì)體培養(yǎng)已獲

成功原生質(zhì)體融合及雜種細(xì)胞培養(yǎng)成株的步驟?

原生質(zhì)體的融合方法：物理的－－電融合法；化學(xué)的

－－PEG（聚乙二醇）誘導(dǎo)法，或PEG和高鈣高pH法?

雜種細(xì)胞的選擇：半選擇體系，即一方親本的原生質(zhì)

體無分裂能力（葉