基于ril群體的抗青枯病花生品種的黃曲霉抗性及含油量研究

基于ril群體的抗青枯病花生品種的黃曲霉抗性及含油量研究

提高花生產(chǎn)量（包括提高生產(chǎn)力和抗病性）和產(chǎn)油量是中國(guó)生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。然而,生產(chǎn)上應(yīng)用的花生品種尤其在青枯病(Ralstoniasolanacearum)疫區(qū)應(yīng)用的抗性品種含油量低,不抗黃曲霉是花生生產(chǎn)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。雖然我國(guó)的抗青枯病育種取得了很大成績(jī),但抗黃曲霉和提高含油量育種徘徊不前,生產(chǎn)上應(yīng)用的抗黃曲霉和高油品種很少。造成這種局面的主要原因是抗黃曲霉種質(zhì)較少,僅有的幾份抗性材料如J11、PI337394F、PI337409等農(nóng)藝性狀差,對(duì)青枯病的抗性弱、籽粒小、產(chǎn)量潛力低、含油量偏低,因此,在育種中的利用效率低,甚至尚未被有效利用。雖然我國(guó)發(fā)掘出了大批抗青枯病種質(zhì),但其含油量低,黃曲霉抗性和農(nóng)藝性狀差?？梢?jiàn),青枯病和黃曲霉抗性與含油量的矛盾影響了抗黃曲霉育種和對(duì)抗青枯病品種其他重要性狀的改良。因此,國(guó)內(nèi)外均迫切需要優(yōu)良的抗黃曲霉兼抗青枯病的高油花生新種質(zhì)。創(chuàng)造具有多個(gè)優(yōu)良性狀的抗青枯病或抗黃曲霉新種質(zhì)是擴(kuò)大花生抗黃曲霉或抗青枯病育種遺傳基礎(chǔ)的重要途徑。本文探索利用重組近交系群體創(chuàng)造兼抗黃曲霉和青枯病的高油優(yōu)良材料,以期為花生突破性育種奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1遠(yuǎn)緣雜種后代遠(yuǎn)雜9102來(lái)源于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,系白沙1016×Arachischacoense的遠(yuǎn)緣雜種后代,屬珍珠豆型,平均含油量53.13%,高抗青枯病,不抗黃曲霉;中花5號(hào)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所培育,系中花1號(hào)×鄂花4號(hào)雜交后代,珍珠豆型,含油量57.07%,高產(chǎn)但高感青枯病,不抗黃曲霉。由遠(yuǎn)雜9102×中花5號(hào)雜交組合產(chǎn)生重組近交系116個(gè)。1.2fps、抗逆性及農(nóng)藝性狀調(diào)查配制遠(yuǎn)雜9102×中花5號(hào)組合,F1代按組合種植,每個(gè)F2植株按單粒傳法處理,在F5代按家系混合收獲,F6代擴(kuò)繁種子并觀察家系內(nèi)部的純合情況,F7~F10代家系進(jìn)行黃曲霉抗性和青枯病抗性鑒定、含油量分析和各種農(nóng)藝性狀調(diào)查。1.3黃曲霉毒素的提取2008—2009年連續(xù)2年選取成熟飽滿(mǎn)、種皮完整的種子用75%酒精表面消毒3min,在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌水漂洗3次,使種子含水量恢復(fù)到約20%,接種黃曲霉菌孢子懸浮液。黃曲霉菌株為本實(shí)驗(yàn)室篩選的強(qiáng)產(chǎn)毒菌株AF2202,每毫升含4×106孢子,接種后振蕩使菌液均勻分布于種子表面,每品種接種40粒,重復(fù)3次。置25℃生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)7d后,用甲醇提取全部接種種子的黃曲霉毒素,用熒光分光光度計(jì)(PerkinElmerLS55)檢測(cè)毒素含量。以中花6號(hào)為抗黃曲霉對(duì)照,R1549為感黃曲霉對(duì)照。1.4青枯病抗性調(diào)查2006—2008年連續(xù)3年于湖北紅安花生青枯病圃,按“七五”至“十五”國(guó)家科技攻關(guān)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查,以群體植株成活率(%)為青枯病抗性的鑒定指標(biāo)。以高抗品種中花6號(hào)為抗病對(duì)照,高感品種鄂花4號(hào)為感病對(duì)照,3次重復(fù)。1.5家系及親本含油量2008—2009年于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植RIL家系及親本,含油量在農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心,按GB/T14488.1-93測(cè)試。1.6試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植材料2008—2009年連續(xù)2年于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植材料,按ICRISAT與IPGRI制定的DescriptorsforGroundnut描述標(biāo)準(zhǔn)取樣和調(diào)查。調(diào)查的性狀包括主莖高、總分枝數(shù)、百果重等。1.7ssr引物合成及pcr擴(kuò)增選取花生健壯幼葉,采用CTAB法提取基因組DNA。用國(guó)際半干旱研究所(ICRISAT)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供的SSR引物序列由上海生工生物工程技術(shù)有限公司或北京奧科公司合成引物,按本實(shí)驗(yàn)室建立的優(yōu)化體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物,銀染顯色,電腦掃描。1.8遺傳特性分析用MicrosoftExcel軟件分析含油量、黃曲霉和青枯病抗性等性狀差異顯著性,參照章元明等的方法分析遺傳特性,用最長(zhǎng)距離法聚類(lèi)分析。2結(jié)果與分析2.1遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)通過(guò)接種培養(yǎng)及毒素檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析,抗產(chǎn)毒對(duì)照中花6號(hào)的平均毒素含量為2537μgkg–1,感病對(duì)照R1549的平均毒素含量為23632μgkg–1,RIL群體的毒素含量3394~50576μgkg–1,毒素含量范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)2個(gè)親本間的差異(2個(gè)親本分別為10401μgkg–1和16368μgkg–1),平均毒素含量12396μgkg–1。毒素含量低于5000μgkg–1的有16個(gè)家系,5000~10000μgkg–1的44個(gè),10000~15000μgkg–1的20個(gè),15000~20000μgkg–1的19個(gè),20000~25000μgkg–1的13個(gè),25000~30000μgkg–1的2個(gè),大于30000μgkg–1的3個(gè),高于中花5號(hào)(16368μgkg–1)的31個(gè),低于遠(yuǎn)雜9102(10401μgkg–1)的60個(gè)?？梢?jiàn),利用親本遺傳背景的差異和互補(bǔ)性,通過(guò)雜交和RIL群體的構(gòu)建能創(chuàng)造出抗黃曲霉產(chǎn)毒的優(yōu)良后代材料。上述檢測(cè)數(shù)據(jù)表明,本研究創(chuàng)造出16份抗黃曲霉產(chǎn)毒種質(zhì),其毒素含量均低于5000μgkg–1。利用MicrosoftExcel軟件對(duì)RIL群體的黃曲霉產(chǎn)毒抗性進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),結(jié)果表明,RIL家系間差異達(dá)顯著水平(F=1.41,F0.05=1.28),年份和重復(fù)間差異均不顯著(F年份=2.53,F0.05=3.86;F重復(fù)=2.44,F0.05=3.02)。利用植物數(shù)量性狀主基因與多基因混合遺傳模型分析P1、P2及RIL群體的黃曲霉產(chǎn)毒抗性的遺傳屬性,結(jié)果表明,花生黃曲霉產(chǎn)毒抗性符合E-2-6模型,為2對(duì)連鎖并具累加作用主基因+加性多基因控制。2.2優(yōu)良抗黃曲霉的群體構(gòu)建通過(guò)RIL群體的青枯病抗性鑒定結(jié)果表明,所涉及材料的青枯病抗性為10.2%~99.6%,平均56.3%?？剐缘陀?0%的有13個(gè)家系,20%~40%的32個(gè),40%~60%的31個(gè),60%~80%的11個(gè),80%~100%的30個(gè)。低于感病親本中花5號(hào)(27.3%)的23個(gè),高于抗病親本遠(yuǎn)雜9102(92.5%)的11個(gè)。可見(jiàn),通過(guò)雜交和RIL群體的構(gòu)建能創(chuàng)造出青枯病抗性比親本更抗的優(yōu)良后代材料。在青枯病抗性達(dá)80%以上的30個(gè)家系中,有J035、J091、J096和J098共4個(gè)家系抗黃曲霉。通過(guò)MicrosoftExcel軟件對(duì)RIL群體的青枯病抗性進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),家系間存在極顯著差異(F=1.50,F0.05=1.42),年份和重復(fù)間差異均不明顯(F年份=1.98,F0.05=3.86;F重復(fù)=2.35,F0.05=3.02)。利用植物數(shù)量性狀主基因與多基因混合遺傳模型分析P1、P2及RIL群體的黃曲霉抗性遺傳屬性,結(jié)果表明,花生黃曲霉產(chǎn)毒抗性符合E-1-0模型,為2對(duì)加性-上位性主基因+加性-上位性多基因控制,與前期研究結(jié)果一致。2.3遺傳穩(wěn)定性和基因型差異顯著性分析RIL群體的含油量分析結(jié)果表明,平均含油量56.0%,變異范圍50.8%~62.1%,含油量低于低油親本遠(yuǎn)雜9102(53.13%)的家系有8個(gè),占6.8%,高于高油親本(57.1%)的32個(gè),占27.3%。含油量達(dá)58%~60%的12個(gè),大于60%的3個(gè),最高含油量達(dá)62.1%(J064),比高油親本中花5號(hào)高5個(gè)百分點(diǎn)以上。這些結(jié)果與早期分析結(jié)果一致,也與黃曲霉抗性鑒定結(jié)果相似,利用親本遺傳背景的差異和互補(bǔ)性,通過(guò)雜交和RIL群體的構(gòu)建能創(chuàng)造出高含油量的優(yōu)良后代材料。在含油量達(dá)58%以上的15個(gè)家系中,有5個(gè)家系抗青枯病,包括J008、J028、J051、J091和J111;3個(gè)家系抗黃曲霉產(chǎn)毒,包括J076、J085和J091。差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明,重復(fù)間差異不明顯(F=2.35,F0.05=3.02),家系和年份間顯著差異(F家系=1.31,F0.05=1.28;F年份=4.03,F0.05=3.86)。相關(guān)分析表明兩年的含油量顯著相關(guān)(r=0.9103)。利用植物數(shù)量性狀主基因與多基因混合遺傳模型分析P1、P2及RIL群體的黃曲霉抗性遺傳屬性,結(jié)果表明,花生黃曲霉產(chǎn)毒抗性符合E-1-9模型,為2對(duì)具抑制作用主基因+加性多基因控制。2.4農(nóng)藝性狀的特征綜合分析RIL群體的黃曲霉產(chǎn)毒和青枯病抗性鑒定結(jié)果以及含油量分析結(jié)果,本研究通過(guò)重組近交系群體的構(gòu)建及各種主要性狀的鑒定,創(chuàng)造獲得了抗黃曲霉或抗青枯病的高油后代18份(表1),其中抗黃曲霉兼抗青枯病種質(zhì)4份,包括J035、J091、J096和J098;抗黃曲霉高油種質(zhì)6份,抗青枯病高油種質(zhì)10份,抗黃曲霉兼抗青枯病的高油種質(zhì)1份J091。18份優(yōu)良材料的平均含油量57.7%,變異范圍54.5%~61.3%;青枯病抗性72.9%,變異范圍21.1%~98.8%;接種條件下的黃曲霉毒素含量8558μgkg–1,變異范圍3394~23662μgkg–1。其中,J091在接種強(qiáng)產(chǎn)毒菌株條件下,平均黃曲霉毒素含量只有3394μgkg–1,青枯病抗性82.5%,含油量59.1%,是創(chuàng)造獲得的抗黃曲霉且高抗青枯病的高油花生新種質(zhì)。另外,J098和J035也是比較優(yōu)良的種質(zhì),J098的平均黃曲霉毒素含量只有3622μgkg–1,青枯病抗性97.5%,含油量56.4%;J035的平均黃曲霉毒素含量只有3512μgkg–1,青枯病抗性83.4%,含油量55.4%。通過(guò)對(duì)18份優(yōu)良后代材料農(nóng)藝性狀的考察,其主莖高22.7cm,變異范圍16.5~29.5cm,總分枝數(shù)平均6.6條,變異范圍4.0~9.2條,百果重184.5g,變異范圍154.4~234.4g,其中,百果重達(dá)180g以上的材料11份,200g以上的4份,其中,抗黃曲霉兼抗青枯病的高油花生新種質(zhì)J091的百果重達(dá)226.3g,J098的百果重達(dá)203.6g,J035的百果重為179.6g。這些結(jié)果表明,18份優(yōu)良后代材料的農(nóng)藝性狀優(yōu)良,植株較矮,分枝數(shù)適中,莢果大,含油量較高,均在54%以上。2.5抗黃曲霉高油種質(zhì)的遺傳聚類(lèi)分析通過(guò)10對(duì)SSR多態(tài)性引物(15C12、16G08、18C05、2A06、2F05、2G03、2G04、7G02、7H06和2D12B)的分析,所獲得的18份抗病高油種質(zhì)存在豐富的遺傳多樣性,但均沒(méi)有超過(guò)親本間的差異。兩兩種質(zhì)之間的平均遺傳距離為0.47,最小距離為0.05,表現(xiàn)在2份抗黃曲霉高油種質(zhì)即J074與J076之間,高油抗青枯病的J013與抗黃曲霉兼抗青枯病的高油種質(zhì)J091之間的距離最大(0.89),親本之間的遺傳距離為1。與中花5號(hào)最相似的是高油抗青枯病種質(zhì)J008,遺傳距離為0.20,與遠(yuǎn)雜9102最相似的是抗黃曲霉兼抗青枯病種質(zhì)J096,遺傳距離為0.11。聚類(lèi)分析結(jié)果表明,18份材料及其親本分為A組和B組。A組包括8份后代材料和親本遠(yuǎn)雜9102,其中抗黃曲霉材料5份,抗黃曲霉兼抗青枯病材料2份,抗黃曲霉高油種質(zhì)3份,抗青枯病高油種質(zhì)3份。B組包括10份后代材料和親本中花5號(hào),其中抗青枯病材料8份,抗青枯病兼抗黃曲霉材料2份,抗黃曲霉高油種質(zhì)2份,抗青枯病高油種質(zhì)6份,抗黃曲霉兼抗青枯病的高油種質(zhì)1份。應(yīng)用相關(guān)軟件分析結(jié)果表明,在所涉及的10對(duì)SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)品中,除7G02/150-190與青枯病抗性有關(guān)外,還未鑒定出與黃曲霉產(chǎn)毒抗性和含油量等性狀相關(guān)的標(biāo)記片段。3黃曲霉抗性和含油量遺傳多樣性分析本研究表明通過(guò)抗青枯病種質(zhì)與高產(chǎn)品種的雜交和重組近交系群體(RIL)的構(gòu)建并在遺傳穩(wěn)定的RIL群體中鑒定和檢測(cè)黃曲霉抗性和含油量是創(chuàng)造抗青枯病兼抗黃曲霉高油種質(zhì)的有效途徑。花生黃曲霉抗性鑒定及含油量分析均需要較多的種子材料,并且過(guò)去黃曲霉毒素定量測(cè)定的技術(shù)難度較大和費(fèi)用較高,抗性鑒定和含油量檢測(cè)難以在低世代群體中開(kāi)展,在很大程度上限制了花生黃曲霉抗性和含油量的系統(tǒng)研究。本研究解決了長(zhǎng)期以來(lái)困擾花生黃曲霉抗性和含油量遺傳研究的技術(shù)難題。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從后代群體青枯病抗性、黃曲霉抗性和含油量的分布以及遺傳統(tǒng)計(jì)分析,明確了花生這些重要性狀的遺傳特性,其中,青枯病抗性遺傳分析結(jié)果與以前的分析結(jié)果一致。花生黃曲霉抗性受2對(duì)連鎖并具累加作用主基因+加性多基因控制,含油量受2對(duì)具抑制作用主基因+加性多基因控制。在花生含油量的遺傳分析方面,禹山林等認(rèn)為含油量受2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+顯性多基因控制。陳四龍等認(rèn)為不同雜交組合中含油量的遺傳特征不同,在所涉及的2個(gè)組合中,1個(gè)組合的含油量受1對(duì)加性-顯性主基因+加性-顯性-上位多基因控制,另一組合為多基因控制,不存在主基因?？梢?jiàn),花生含油量遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜,不同研究者利用不同材料獲得的研究結(jié)果不同。另外,在本研究中,對(duì)RIL群體的黃曲霉抗性和含油量均分離出超親類(lèi)型,如J035、J091、J098等家系的毒素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于毒素含量相對(duì)較少的親本,含油量超過(guò)高油親本的家系32個(gè)。這些結(jié)果都表明,兩親本相關(guān)控制基因的不同或存在等位點(diǎn)的差異,通過(guò)累加效應(yīng)產(chǎn)生了超親類(lèi)型,由于黃曲霉抗性和含油量除受主基因控制外,還受加性效應(yīng)基因控制,均能穩(wěn)定遺傳給后代,可以顯著提高花生黃曲霉抗性和含油量水平。這為花生黃曲霉抗性和含油量的遺傳改良提供了一條新的途徑。對(duì)優(yōu)良種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析,是種質(zhì)資源有效利用的基礎(chǔ)。通過(guò)SSR分析,18份優(yōu)良后代