中國近交系版納微型豬

中國近交系版納微型豬

1豬細(xì)胞內(nèi)1,3-gt基因改造目前，在同異體移植中，體移植的嚴(yán)重不足，導(dǎo)致了不同移植的研究。豬因其器官在功能、形態(tài)、理化性質(zhì)上與人類較為匹配而逐漸成為人異種移植的首選供體和研究開發(fā)的熱點(diǎn)。但豬-人器官移植過程中,由α-Gal引發(fā)的宿主抗移植物(Hostversusgraft,HVG)超急期免疫排斥反應(yīng)是豬器官成功用于臨床移植必須克服的首要障礙。為此,一些研究者嘗試著對(duì)豬細(xì)胞內(nèi)α1,3-GT基因進(jìn)行改造,以最大限度抑制其合成α-Gal的能力,如針對(duì)α1,3-GT基因的RNA干擾技術(shù),反義核苷酸技術(shù)、基因敲除等。已有的研究表明,用于基因改造的豬應(yīng)該遺傳背景清楚、穩(wěn)定,這樣才能使被改造的目的基因既能高效表達(dá),又能穩(wěn)定遺傳。由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾養(yǎng)志教授培育的中國近交系版納微型豬具有近交系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn),是改造豬α1,3-GT基因的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但到目前為止,版納近交系微型豬α1,3-GT基因克隆的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從版納微型豬肝臟中提取總RNA,RT-PCR擴(kuò)增出α1,3-GTcDNA全長(zhǎng)序列并克隆至pMD18-T載體測(cè)序,測(cè)序后的α1,3-GT基因定向克隆到質(zhì)粒pEGFP-N1中,構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-GT。將pEGFP-N1-GT轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549,RT-PCR檢測(cè)α1,3-GTmRNA的表達(dá),直接免疫熒光法觀察α-Gal表位在人細(xì)胞膜上的合成情況。2材料方法2.1材料表面2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)和培養(yǎng)近交系版納微型豬由四川大學(xué)華西醫(yī)院移植免疫實(shí)驗(yàn)室提供,為云南大學(xué)曾養(yǎng)志教授培育。肺腺癌細(xì)胞株A549為本室保存,用含有15%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。大腸桿菌JM109由本室保存。2.1.2單粒含巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的質(zhì)粒pEGFP-N1系Clontech產(chǎn)品,由四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院黃寧教授惠贈(zèng)。2.1.3pcr和熒光素提取試驗(yàn)劑RPMI1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品,質(zhì)粒DNA小量抽提UltraPureTM試劑盒、olig-T以及RT-PCR引物由北京賽百盛公司提供,Biozol總RNA提取試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶為Promega產(chǎn)品,高保真KOD-PlusDNApolymerase系TOYOBO公司產(chǎn)品,限制性核酸內(nèi)切酶以及DNA連接試劑盒DNALigationKit均為Takara公司產(chǎn)品,DNA回收試劑盒為V-gene公司產(chǎn)品,熒光素標(biāo)記的植物凝集素為Vector公司產(chǎn)品。熒光倒置顯微鏡為OlympusIX-71型。2.2方法2.2.1逆轉(zhuǎn)錄酶pcrm-mlv①取新鮮版納微型豬肝臟組織50mg,迅速放入預(yù)先液氮預(yù)冷的研缽中,快速研磨至粉末,按Biozol總RNA提取操作手冊(cè)提取肝組織總RNA,紫外分光光度和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。②RT-PCR以提取的總RNA為模板,按照以下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄:OligT(0.33μg/mL)6μl,RNA3μl,ddH2O3μl,70℃5min,冰浴2min后,順序加入M-MLV5×buffer5μl,dNTP(10Mm)1.25μl,ddH2O5μl,RNA酶抑制劑0.75μl,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl,42℃90min。α1,3-GT的PCR擴(kuò)增:根據(jù)GenBank中豬α1,3-GT的CDS序列(NM213810)設(shè)計(jì)引物,F:5′-CCGGAATTCATGAATGTCAAAGGAAGAG-TG-3′,5′端引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的酶切切位點(diǎn)(下劃線表示),R:5′-CGGGGTACCTCAGATGTTATTTCTAACCAAATT-3′,5′段引入限制性內(nèi)切酶KpnⅠ的酶切切位點(diǎn)(下劃線表示)。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板PCR擴(kuò)增版納微型豬α1,3-GT的全長(zhǎng)序列,反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性2min,94℃30s,58℃30s,72℃2min,33個(gè)循環(huán),72°后延伸10min。PCR產(chǎn)物用8g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。③約1.1kb的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收,常規(guī)T-A克隆至pMD18-T,經(jīng)藍(lán)白斑篩,挑取陽性克隆交由天泰公司測(cè)序。2.2.2質(zhì)粒雙酶切t-1,3-gt和pegfp-dna的制備將含全長(zhǎng)1116bpα1,3-GT的pMD18-T-α1,3-GT質(zhì)粒菌種解凍,挑取冰渣,于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿上劃板,37℃恒溫箱培養(yǎng)16h,挑取單菌落于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜,按質(zhì)粒提取試劑盒說明書抽提質(zhì)粒pMD18-T-α1,3-GT。同法獲取質(zhì)粒pEGFP-N1。EcoRⅠ和KpnⅠ,37℃過夜雙酶切質(zhì)粒pMD18-T-α1,3-GT和pEGFP-N1。8g/L的TAE瓊脂糖凝膠電泳pMD18-T-α1,3-GT雙酶切產(chǎn)物,DNA回收試劑盒切膠回收約1.1kb的α1,3-GT基因片段。DNA回收試劑盒直接純化回收pEGFP-N1的酶切后的骨架載體。將上述pMD18-T-α1,3-GT酶切回收產(chǎn)物與pEGFP-N1酶切后的骨架載體以α1,3-GT(mol)∶pEGFP-N1(mol)為3∶1的比例,按連接試劑盒操作說明,16℃連接過夜。取連接反應(yīng)液10μl轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109,用SOC培養(yǎng)液37℃恒溫箱培養(yǎng)1h后,涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板,37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落,于含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,37℃恒溫振蕩培養(yǎng)過夜,用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。選用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切,EcoRⅠ、KpnⅠ單酶切以及PCR方法鑒定pEGFP-N1-GT。2.2.3pegfp-n-gt-級(jí)配對(duì)、生長(zhǎng)和提取細(xì)胞的制備在96孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1.5×104個(gè)/孔,用不含抗生素但含15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,至細(xì)胞鋪滿孔底95%時(shí),用不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基洗兩次。按每孔0.2μg質(zhì)粒/0.5μl脂質(zhì)體,用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基分別稀釋脂質(zhì)體和pEGFP-N1-GT質(zhì)粒至25μl,室溫5min。將稀釋后的脂質(zhì)體和質(zhì)?；旌喜⑤p柔混勻,室溫靜置20min。加入脂質(zhì)體-DNA混合物50μl/孔,輕輕混勻。培養(yǎng)6h后向孔中加入等體積的含30%小牛血清的無抗生素DMEM培養(yǎng)基,24h后檢測(cè)A549細(xì)胞上α-gal的合成。同法,相應(yīng)擴(kuò)大細(xì)胞接種量和質(zhì)粒及脂質(zhì)體的用量,在30cm2培養(yǎng)瓶中將pEGFP-N1-GT轉(zhuǎn)染至A549,用于檢測(cè)α1,3-GTmRNA的表達(dá)。2.2.4逆轉(zhuǎn)錄和熒光顯微鏡檢測(cè)①轉(zhuǎn)染細(xì)胞中α1,3-GTmRNA的表達(dá):取上述30cm2培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,PBS洗兩遍,3mMEDTA消化單層貼壁生長(zhǎng)的A549細(xì)胞,按照BIzol總RNA提取操作方法,分別提取轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-GT表達(dá)載體和未轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的A549細(xì)胞的總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)量260nm/280nm吸光度比值和8g/L的TBE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。以提取的總RNA為模板,按照2.2.1的方法逆轉(zhuǎn)錄得到α1,3-GT的cDNA。根據(jù)GenBank中豬α1,3-GT的序列(NM_213810)及內(nèi)對(duì)照(人β-actin)的序列設(shè)計(jì)引物,F1:5′-TCAATGCTGCTTGTCTCA-3,R1:5′-TAAGTGCCTTCCCATA-3′(擴(kuò)增300bp的α1,3-GT片段);F2:5′-GACTACCTCATGAAGATC-3′,R2:5′-GATCCACATCTGCTGGAA-3′(擴(kuò)增500bp的β-actin片段)。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),條件如下:94℃預(yù)變性2min,94℃30s,50℃30s,72℃2min,33個(gè)循環(huán),72℃后延伸10min。PCR產(chǎn)物用15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。②轉(zhuǎn)染細(xì)胞中α-Gal合成:植物凝集素(BS-IB4lectin)能和α-Gal特異性結(jié)合,故本實(shí)驗(yàn)采用熒光素標(biāo)記的凝集素(FITC-BS-IB4lectin),檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中α-Gal的合成。取96孔板中轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-GT的A549細(xì)胞,PBS洗兩次,加入用RPMI1640培養(yǎng)基按1∶50稀釋后的FITC-lectin100μl,室溫下避光孵育15min。PBS洗兩遍,于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中α-Gal的表達(dá)情況。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A549細(xì)胞為對(duì)照。3結(jié)果3.1總rna質(zhì)量測(cè)定版納微型豬肝臟總RNA電泳顯示28S,18S,5S三條帶清晰,260nm/280nm吸光度比值為1.92,表明提取的總RNA質(zhì)量較好。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)8g/L的TBE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示,從版納微型豬肝臟中擴(kuò)增出來的目的片段長(zhǎng)約1.1kb,與預(yù)期大小相符(見圖1)。3.2豬1,3-gt基因分析RT-PCR擴(kuò)增出來的α1,3-GT基因產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆測(cè)序,結(jié)果表明BMIα1,3-GT基因全長(zhǎng)1116bp,與GenBank中公布的小鼠、牛的α1,3-GT基因具有高度同源性,與普通豬α1,3-GTcDNA全長(zhǎng)序列完全一致(見圖2)。3.3pegfp-dna擴(kuò)增pEGFP-N1-GT經(jīng)EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切,電泳顯示在4.7kb和1.1kb附近出現(xiàn)清晰的DNA條帶;EcoRⅠ、KpnⅠ分別單酶切pEGFP-N1-GT均得到約5.8kb的DNA條帶,與理論值吻合。同時(shí)以pEGFP-N1-GT重組質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)α1,3-GT,PCR產(chǎn)物電泳,在1.1kb位置出現(xiàn)清晰DNA條帶。酶切和PCR兩種方法鑒定結(jié)果均證明pEGFP-N1-GT真核表達(dá)載體構(gòu)建成功(見圖3)。3.4細(xì)胞中1,3-gtmrna的表達(dá)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-GT的A549細(xì)胞中有α1,3-GTmRNA的表達(dá),而未轉(zhuǎn)染的人A549細(xì)胞無α1,3-GTmRNA的表達(dá)(見圖4)。3.5t組未見-gal的表達(dá)熒光倒置顯微鏡下,可以觀察到在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-GT的A549細(xì)胞膜上,α-Gal有不同強(qiáng)度的表達(dá)。未轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-GT組未見α-Gal的表達(dá)(見圖5)。(a)lightmicrographofnon-transfectedA549;(b)fluorescencemicrographofnon-transfectedA549;(c)lightmicrographoftransfectedA549;(d)fluorescencemicrographoftransfectedA5494-gt基因敲除豬目前,器官來源短缺嚴(yán)重阻礙了器官移植的臨床推廣。尋求能夠代替人的供體動(dòng)物已成為解決這一難題的新選擇。豬因其器官與人器官在生理結(jié)構(gòu)和生化功能上很相似、繁殖能力強(qiáng)、飼養(yǎng)方便、不涉及倫理學(xué)等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是異種器官移植的最佳供體動(dòng)物。移植免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在豬、小鼠等非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在著α-Gal表位,人由于負(fù)責(zé)合成α-Gal的α1,3-GT基因的缺失突變,不能合成這種表位,但在胃腸道表達(dá)α-Gal微生物的刺激下,人體內(nèi)產(chǎn)生了大量的天然抗α-Gal抗體。當(dāng)豬器官移植到人體后,人血清中天然存在的抗α-Gal抗體能迅速和豬細(xì)胞上的α-Gal結(jié)合,在數(shù)分鐘內(nèi)引發(fā)強(qiáng)烈的超急期免疫排斥反應(yīng)(HAR)。過去的幾年中,嘗試用于克服HAR的方法有很多,如免疫吸附抗α-Gal抗體,阻斷補(bǔ)體激活等,這些方法僅在一定程度上減緩了HAR的發(fā)生,并不能徹底消除HAR。從理論上講,消除豬-人器官移植中HAR最理想的方法是培養(yǎng)出不表達(dá)α-Gal的豬。Lai和Kolber-Simondsl的研究小組,利用基因打靶技術(shù)將豬細(xì)胞α1,3-GT基因敲除,然后通過體細(xì)胞克隆技術(shù),先后培育出了α1,3-GT基因雜合性敲除和純合性敲除的豬,為α1,3-GT基因敲除豬用于異種器官移植提供了理想的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究模型。2005年,Schroeder等將人新鮮血液貫注GT純合性敲除豬和GT+豬的肺臟,一系列生理學(xué)、組織化學(xué)方法用于評(píng)價(jià)貫注后的肺功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GT敲除的豬肺功能持續(xù)時(shí)間為2h,而GT+的豬肺在貫注人血液后5min失去功能?；铙w動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí),將GT基因敲除的豬腎或心臟移植到狒狒(GT-/anti-Gal+)后,移植物的存活時(shí)間組明顯延長(zhǎng)。雖然α1,3-GT基因敲除的個(gè)體豬已培育成功,但要獲得遺傳穩(wěn)定性好、數(shù)量能夠滿足臨床需要的群體豬必須選擇近交系豬體細(xì)胞作為敲除的對(duì)象。如果使用非近交系或近交系數(shù)不高的豬作α1,3-GT基因敲除,即便培育成功,也不能穩(wěn)定遺傳和快速繁殖擴(kuò)大群體數(shù)量。由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾志教授培育的中國近交系版納微型豬到2001年進(jìn)入19世代,近交系數(shù)可達(dá)到98.3%,具有遺傳背景清楚、基因高度穩(wěn)定,一致的特點(diǎn),非常適合作α1,3-GT基因敲除研究。然而,到目前為止,版納近交系微型豬α1,3-GT基因的背景資料尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)從版納微型豬肝臟中提取總RNA,RT-PCR擴(kuò)增出α1,3-GTcDNA全長(zhǎng)序列并克隆到pMD18-T載體,測(cè)序顯示α1,3-GTcDNA全長(zhǎng)1116bp,這一結(jié)果與GenBank中已經(jīng)公布的小鼠和牛的α1,3-GT序列(NM_010283,NM_177511)具有高度的同源性,與豬α1,3-GTcDNA全長(zhǎng)序列(NM_213810)完全一致。將克隆的版納微型豬α1,3-GT基因構(gòu)建成真核表達(dá)載體pEGFP-N1-GT,轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞A549中。Marion等的研究表明,人α1,3-GT基因Ⅶ內(nèi)含子中存在強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào),使得人α1,3-GTmRNA只轉(zhuǎn)錄出Ⅳ～Ⅶ外顯子,導(dǎo)致人體中存在著截短的、無功能的α1,3-GT。因此,在本實(shí)驗(yàn)中,選擇豬α1,3-GT基因第Ⅳ和第Ⅷ外顯子區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物以排除人