蛋白A親和層析介質(zhì)

蛋白A親和層析介質(zhì)（征求意見稿）編制說明《蛋白A親和層析介質(zhì)》國標起草工作小組一月《蛋白A親和層析介質(zhì)》國標編制說明（征求意見稿）一、任務來源本國標的制訂任務列入國標化管理委員會專項《國家質(zhì)量基礎的共性技術(shù)研究與應用》項目《生物產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)原則研究》中課題《海洋生物產(chǎn)品質(zhì)量控制與檢測技術(shù)原則研究》，項目編號“YFF004”。本項任務由中國原則化研究院提出并歸口，定于完畢。本原則起草工作組由中國科學院過程工程研究所等單位共同構(gòu)成。二、目的和意義單抗藥品對生產(chǎn)制造純化工藝的效能和成本規(guī)定非常高，單抗分離純化成本占其生產(chǎn)總成本的50-70%，其中蛋白A親和層析介質(zhì)是其生產(chǎn)的核心原材料之一，其性質(zhì)和成本將決定單抗產(chǎn)品的最后身產(chǎn)成本、純度和收率?，F(xiàn)在，80%以上的抗體純化使用蛋白A親和層析。蛋白A親和層析介質(zhì)的載量、穩(wěn)定性等是單抗純化選擇介質(zhì)時的首要考慮。蛋白A來源于金黃色葡萄球菌的一種株系，它含有5個能夠和抗體分子Fc段特異性結(jié)合的構(gòu)造域。將蛋白A偶聯(lián)至基質(zhì)上（以瓊脂糖基質(zhì)為主）制成蛋白A親和層析介質(zhì)，能夠與抗體特異性結(jié)合，選擇性極高，一步親和層析可達成95%以上的純度。蛋白A親和層析因特異性強、操作簡樸、解決量大等優(yōu)勢，已成為抗體藥品研發(fā)和生產(chǎn)階段的核心純化環(huán)節(jié)。蛋白A親和層析介質(zhì)作為單抗藥品生產(chǎn)過程的核心分離材料之一，其性質(zhì)和成本決定單抗產(chǎn)品的最后純度、收率和生產(chǎn)成本。我國現(xiàn)在尚未建立對應的國家及行業(yè)原則，國內(nèi)市場上的蛋白A親和層析介質(zhì)產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，缺少產(chǎn)品生產(chǎn)、檢查和質(zhì)量規(guī)范。這在一定程度上限制了我國蛋白A親和層析介質(zhì)的發(fā)展及有關層析技術(shù)的應用，更妨礙了國內(nèi)單抗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展水平。因此建立蛋白A親和層析分離介質(zhì)的國標，對于規(guī)范蛋白A親和介質(zhì)行業(yè)，推動層析技術(shù)應用，以及增進單抗產(chǎn)業(yè)發(fā)展，均含有重要的理論和現(xiàn)實意義?，F(xiàn)在，蛋白A親和層析介質(zhì)的性能參數(shù)測定辦法多個多樣，以動態(tài)載量測定辦法為例，一種是將介質(zhì)裝柱并連在層析儀上，平衡，上樣抗體，待流出液濃度與上樣濃度相等時上樣結(jié)束，依次經(jīng)淋洗、洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液體積及洗脫液濃度，計算洗脫載量。另一種則是將介質(zhì)裝柱并連接到層析儀上，平衡、上樣抗體，根據(jù)穿透曲線，以5%穿透處介質(zhì)對抗體的吸附量進行載量計算。尚有則是在第二種辦法的基礎上按照10%穿透處介質(zhì)對抗體的吸附量進行載量計算。這三種辦法測定同一介質(zhì)樣品得到的成果都有明顯差別。由于測定辦法不同產(chǎn)生的類似問題也出現(xiàn)在其它參數(shù)測定上。這些差別對于介質(zhì)的應用存在諸多不便。因此，建立蛋白A親和層析介質(zhì)國標，能夠規(guī)范蛋白A層析介質(zhì)的生產(chǎn)與檢查過程，增進介質(zhì)和有關層析技術(shù)在單抗生產(chǎn)等領域的應用，并對推動我國層析介質(zhì)在世界范疇內(nèi)的應用均含有重要意義。三、原則制訂原則（一）原則編制原則蛋白A親和層析介質(zhì)屬于生物體系分離材料，重點圍繞介質(zhì)的重要性能規(guī)定，設定對應技術(shù)內(nèi)容。在確保產(chǎn)品質(zhì)量的基礎上，充足體現(xiàn)產(chǎn)品的特點。（二）原則制訂重要根據(jù)1、原則編寫遵照GB1.1-《原則化工作導則第1部分：原則的構(gòu)造和編寫規(guī)則》的有關規(guī)定。2、原則編寫內(nèi)容參考我國與化學品有關的法規(guī)、原則，涉及GB/T601化學試劑原則滴定溶液的制備、GB/T603化學試劑實驗辦法中所用制劑及制品的制備等等。四、原則重要技術(shù)內(nèi)容（一）原則合用范疇的闡明本原則規(guī)定了蛋白A親和層析介質(zhì)的質(zhì)量規(guī)定、檢測辦法、檢查規(guī)則、標志、包裝、運輸和貯存的原則。本原則合用于骨架為瓊脂糖微球的分離介質(zhì)的生產(chǎn)與檢測。（二）內(nèi)容提綱蛋白A親和層析介質(zhì)的重要理化性質(zhì)涉及外觀、粒徑及分布、耐受壓力強度測試、配基密度、動態(tài)載量、微生物污染等。2.1外觀2.1.1辦法提綱采用光學顯微鏡觀察蛋白A親和層析介質(zhì)的外觀形貌。光學顯微鏡使用普及率高，可觀察范疇普通在數(shù)微米到數(shù)百微米之間，樣品解決過程和觀察過程都簡便易行，觀察成果清晰、重復性好，是慣用的材料外觀表征辦法之一[1]。蛋白A親和層析介質(zhì)的外觀形貌重要涉及球形和透明性，其尺寸大小在光學顯微鏡的測量范疇內(nèi)[2]。2.1.2試劑和材料實驗用水應符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。光學顯微鏡。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.10MPa。2.1.3樣品前解決用量筒量取5mL蛋白A親和層析介質(zhì)，置于50mL砂芯漏斗中。用三級水清洗5次，每次2min，抽干5min。將洗凈的蛋白A親和層析介質(zhì)置于燒杯中，介質(zhì)上應有2cm的三級水。混勻后得到蛋白A親和層析介質(zhì)與水的混合體系。2.1.4樣品觀察用塑料吸管吸取1mL蛋白A親和層析介質(zhì)與水的混合體系置于載玻片上，調(diào)節(jié)顯微鏡放大倍數(shù)。以視野里80%以上面積均為介質(zhì)為原則，用塑料吸管增減載玻片上的微球，最后用蓋玻片壓上。調(diào)節(jié)光學顯微鏡焦距，使視野中的影像清晰。拍攝蛋白A親和層析介質(zhì)照片并保存。圖1蛋白A親和層析介質(zhì)光學顯微鏡照片2.1.5辦法驗證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進行復核驗證。2.2粒徑及其分布2.2.1辦法提綱粒徑和粒徑分布是微球最基本的性質(zhì)參數(shù)，對流速和分辨率都有重要影響[1]。蛋白A親和層析介質(zhì)是球形顆粒，其大小用直徑來量度。微球用于生化分離介質(zhì)時，其粒徑普通較小。常見的蛋白A親和層析介質(zhì)粒徑范疇是45-165μm，平均粒徑是90μm[3]。采用激光粒度分析儀測定蛋白A親和層析介質(zhì)的粒徑辦法十分簡便[1]。平均粒徑及其粒徑分布的定義以下：d其中di為單個介質(zhì)的粒徑，dn為所統(tǒng)計的一定數(shù)量介質(zhì)顆粒的平均值，N為所統(tǒng)計的介質(zhì)顆粒的數(shù)目。2.2.2試劑和材料實驗用水應符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.1MPa。2.2.3樣品前解決辦法同2.1.3。2.2.4樣品測定設立測量顆粒類型為通用型，分散劑類型為水，分析模式為單峰模式，添加樣品進行測定。通過激光粒度儀的檢測成果涉及平均粒徑值及其分布圖。以45-165μm為例，根據(jù)粒徑分布（如圖1中表格）按公式（1）計算該粒徑范疇內(nèi)微球數(shù)量所占比例。W粒徑式中：W粒徑——45-165μm粒徑范疇內(nèi)微球數(shù)量所占比例，單位是%；W1，W2，……Wx——符合45-165μm范疇的各粒徑范疇比例，例如圖2中52.481μm-60.256μm的球所占比例為2.85%。體積平均粒徑按公式（2）計算：dv圖2蛋白A親和層析介質(zhì)粒徑分布圖2.2.5允許差同一試樣三次測定成果之差，應不超出平均值的5%。表1精密度實驗（n=3）實驗序號平均粒徑值（μm）W粒徑187.947100%287.953100%387.968100%x87.956100%s0.00880RSD(%)0.0102.2.6辦法驗證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進行復核驗證。2.3耐受壓力強度測試2.3.1辦法提綱層析過程中，易于裝柱、流速較快、有助于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)等，這些都對介質(zhì)構(gòu)造提出一定規(guī)定。介質(zhì)骨架的剛性直接影響其水力學通透性，良好的機械強度確保介質(zhì)在流動相的靜壓力作用下不會變形[4]。普通用壓力-流速曲線表達流速與柱壓之間的關系[5]。該曲線以柱壓為橫坐標，柱流速為縱坐標，反映了介質(zhì)的機械強度。機械強度較高的介質(zhì)耐壓性能好，在較高壓力下仍能保持較快流速，從而大大節(jié)省了層析操作時間，層析效率得以提高。過軟的基質(zhì)對液體阻力大，影響流速，延長層析操作時間。層析系統(tǒng)操作簡便，自動化程度高，流速和壓力設定精確，測定重復性好，是測定介質(zhì)壓力-流速曲線的通用辦法。2.3.2試劑和材料實驗用水應符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.10MPa。中低壓層析系統(tǒng)。2.3.3樣品前解決辦法同2.1.3。2.3.4樣品測定裝柱：將蛋白A親和層析介質(zhì)與水的混合漿液倒入層析柱中，堵住柱子出口，靜置，待柱床層穩(wěn)定（Φ1.60cm×10.00cm），柱子上端充滿水。打開柱子入口，持續(xù)向柱中通入三級水（10個柱體積），保持床層穩(wěn)定。測定：將層析柱連入中低壓層析系統(tǒng)。測定時，從零開始設定一定流速Vx（mL/min），保持該流速5min后，統(tǒng)計此時柱壓Px(MPa)。繼續(xù)增加流速，并測定對應流速下的柱壓。直到壓力達成0.10Mpa為止。2.3.5成果表達按公式（3）計算線速度。以線速度（V）與壓力（Px）之間的關系作圖，由圖讀取最大流速（如圖2）。V=式中：V——線速度，單位為厘米每小時cm/h；Vx——流速，單位為毫升每分鐘mL/min；S——層析柱截面積，單位為平方厘米cm2。圖3蛋白A親和層析介質(zhì)壓力-流速曲線2.3.6允許差同一試樣三次測定成果之差，應不超出平均值的10%。表2精密度實驗（n=3）實驗序號最大流速值（cm/h）139024203420x410s14.1RSD(%)3.442.3.7辦法驗證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進行復核驗證。2.4配基密度2.4.1辦法提綱親和層析能夠從復雜的多組分混合物中有選擇性地吸附目的蛋白質(zhì)，一次純化就能夠達成電泳純。正由于親和配基的特異性吸附的能力，也就造成了親和層析介質(zhì)的價格昂貴。制備性能穩(wěn)定的親和層析介質(zhì)，其核心之處就是要合理的控制配基密度，配基指的是連接在介質(zhì)骨架上起吸附作用的的分子，如酶、染料、金屬離子等[6]。對于蛋白A親和層析介質(zhì)，其配基就是蛋白A。合理的配基密度不僅是親和介質(zhì)的載量達標的先決條件，也是控制親和介質(zhì)成本的必要手段。凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種辦法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉(zhuǎn)變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來并為過量的硼酸液吸取，再以原則鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質(zhì)含量，故此法是典型的蛋白質(zhì)定量辦法。運用此法，我們能夠簡樸便捷地對蛋白A親和層析介質(zhì)的配基密度進行標定，從而能夠更加好的控制蛋白A親和層析介質(zhì)的性能。2.4.2試劑和材料實驗用水應符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.10MPa。中低壓層析系統(tǒng)。2.4.3樣品前解決辦法同2.1.3。2.4.4樣品測定2.4.4.1蛋白A原則曲線建立精確稱量10.0mg蛋白A，溶于1mL水中。配制10mg/mL、6mg/mL、3mg/mL、1.25mg/mL蛋白A原則溶液。精確量取1mL蛋白A原則溶液，將溶液無損失地轉(zhuǎn)移到100mL凱氏燒瓶中，加入50mg硒粉和5mL濃硫酸。置于電爐上加熱。先用小火慢慢加熱至液體呈透明淡綠色（約2h），然后改用大火繼續(xù)加熱30min，當液體澄清透明后停止加熱并冷卻。凱氏定氮儀進行測定：加入10mL40%的氫氧化鈉溶液，蒸氣浴進行反映。用25mL含2%硼酸的溶液（加入5-6滴甲基紅-溴甲酚綠批示劑，淺紫色）收集餾出液，冷凝器的出液口浸于硼酸溶液液面下列。硼酸溶液的體積達成45mL時冷凝器的出液口離開液面，用去離子水沖洗冷凝器的出液口，至最后體積為50mL時停止收集。用0.05M的鹽酸原則溶液滴定上述硼酸溶液至灰色或藍紫色為終點，并統(tǒng)計消耗鹽酸原則溶液的體積。以消耗鹽酸原則溶液的體積和對應蛋白A的質(zhì)量建立線型關系得到原則曲線。圖4蛋白A原則曲線擬合得到蛋白A原則曲線：y=0.1187x-0.0851，R2=0.9948。2.4.4.2配基密度測定精確稱取1.00g介質(zhì)樣品，移入干燥的100mL凱氏燒瓶中。后續(xù)操作按照2.4.4.1進行。同時取1.00g空白介質(zhì)進行上述操作，做空白對照。2.4.5允許差同一試樣三次測定成果之差，應不超出平均值的5%。表3精密度實驗（n=3）實驗序號配基密度（mg/mL）17.6627.6036.94x7.40s0.3245RSD(%)4.382.4.6辦法驗證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進行復核驗證。2.5動態(tài)載量2.5.1辦法提綱親和介質(zhì)的載量是評價介質(zhì)性能的最重要因素之一。指親和層析介質(zhì)最多能夠吸附上的目的蛋白的量。親和介質(zhì)的載量重要由兩類有關的的參數(shù)決定：1.對的選擇基質(zhì)、間隔分子和配基，使被吸附的蛋白與配基的互相作用最佳化；2.決定吸附載量的多個動力學因素如流速、平衡時間和吸附方式。測定辦法普通采用前沿分析法。將一定濃度的目的蛋白樣品持續(xù)的加到親和介質(zhì)上，并監(jiān)測其流出狀況。當柱床吸附飽和時，流出液和樣品溶液為同一濃度[7]。再通過變化緩沖液的構(gòu)成，pH、離子濃度、或溫度等，將新的緩沖液注入柱中，遍能有效的洗脫吸附的蛋白質(zhì)。普通通過測定洗脫下的蛋白質(zhì)的量，并認為其為該介質(zhì)的載量。另一種則是將介質(zhì)裝柱并連接到層析儀上，平衡、上樣抗體，根據(jù)穿透曲線，以5%穿透處介質(zhì)對抗體的吸附量進行載量計算。尚有則是在第二種辦法的基礎上按照10%穿透處介質(zhì)對抗體的吸附量進行載量計算。本原則采用10%穿透法進行載量測定，重要耗時短，樣品損耗低，與真實載量靠近，且測定重復性好，是測定蛋白A介質(zhì)動態(tài)載量的最優(yōu)辦法。2.5.2試劑和材料實驗用水應符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.10MPa。中低壓層析系統(tǒng)。2.5.3樣品前解決辦法同2.1.3。2.5.4樣品測定將層析柱連在層析系統(tǒng)中，對載量測定過程進行監(jiān)控。動態(tài)結(jié)合載量用10%臨界值表達，檢測280nm處吸取值。測量并統(tǒng)計樣品hIgG的100%UV信號，涉及不結(jié)合到介質(zhì)上的IgG亞類的紫外吸取。用BufferA以2ml/min的流速至紫外基線平衡；以保存時間為5min的流速上樣，待流穿曲線中hIgG的UV信號濃度為10%的樣品濃度（UV信號）時上樣結(jié)束，統(tǒng)計上樣體積。上樣結(jié)束后用BufferA以2ml/min的流速平衡紫外信號至基線；用BufferB以2ml/min的流速進行洗脫。計算動態(tài)結(jié)合載量。圖6是蛋白A親和層析介質(zhì)載量測定層析譜圖。圖5蛋白A親和層析介質(zhì)載量測定層析譜圖2.5.5成果表達以柱出口蛋白濃度C與入口蛋白濃度C0之比值C/C0與流出液體積作圖，即介質(zhì)的穿透曲線。以柱出口蛋白濃度C達成入口蛋白濃度C0的10%時，介質(zhì)的吸附容量為介質(zhì)的動態(tài)載量，根據(jù)公式(4)計算:Q10%=C0式中:Q10%——介質(zhì)的動態(tài)載量，單位為毫克每毫升mg/ml；C0——蛋白起始濃度，單位為毫克每毫升mg/mL；V1——柱出口蛋白濃度C達成入口蛋白濃度C0的10%時流出液體積，單位為毫升mL；V0——管路的死體積，單位為毫升mL；Vgel——介質(zhì)體積，單位為毫升mL。2.5.6允許差同一試樣三次測定成果之差，應不超出平均值的10%。表4精密度實驗（n=3）實驗序號動態(tài)載量（mghIgG/mL介質(zhì)）141.28240.32341.08x40.89s0.41RSD(%)1.012.5.7辦法驗證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進行復核驗證。2.6微生物污染2.6.1辦法提綱微生物對分離介質(zhì)的污染，不僅影響介質(zhì)本身的質(zhì)量，更嚴重的是它會在層析過程中影響生物制品的質(zhì)量，進而對患者的健康和安全造成危害。因此，將分離介質(zhì)的微生物污染狀況作為產(chǎn)品的一種質(zhì)量指標，以避免和控制微生物對分離介質(zhì)的污染，這對提高分離介質(zhì)的質(zhì)量和確保其使用安全性都含有十分重要的意義。普通以介質(zhì)在培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)一段時間繁殖形成的菌體數(shù)目進行評價。其中，由單個細菌（或其它微生物）、細胞或一堆同種細胞在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度，形成肉眼可見的子細胞群落，定義為菌落。在活菌培養(yǎng)計數(shù)時，由單個菌體或聚集成團的多個菌體在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落，成為菌落形成單位（Colony-FormingUnits，簡稱CFU），以其體現(xiàn)活菌的數(shù)量，即微生物污染狀況。2.6.2試劑和材料實驗用水應符合GB/T6682-1992中三級規(guī)定。胰蛋白胨大豆瓊脂。恒溫箱（±0.5℃）。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.1MPa。旋渦混合器。2.6.3樣品前解決（1）辦法同2.1.3。（2）在空培養(yǎng)皿底部標記樣品名稱。按照（GBT5475-離子交換樹脂取樣辦法）直接從產(chǎn)品中抽取5mL蛋白A親和層析介質(zhì)樣品，置于50mL砂芯漏斗中抽干5min。取1mL抽干介質(zhì)，加入1mL三級水，采用旋渦混合器混勻樣品。將含有30mL胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基的錐形瓶進行高溫滅菌（121°C，20min），待培養(yǎng)基冷卻到40°C時，用微量移液器吸取1mL混勻后的樣品加入到該錐形瓶中，緩緩混合，把混合物倒入培養(yǎng)皿中，蓋好上蓋。2.6.4樣品測定凝固混合物：在室溫下使混合物凝固。孵育：把培養(yǎng)皿置于恒溫箱中孵育。在孵育期間培養(yǎng)皿需要倒置，在35℃中放置5天。2.6.5成果表達孵育期后檢查培養(yǎng)皿。計數(shù)菌落形成單位數(shù)（CFU），預計每毫升樣品中微生物的數(shù)量。圖6蛋白A親和層析介質(zhì)菌落生長狀況實物圖2.6.6允許差同一試樣三次測定成果之差，應不超出5。表5精密度實驗（n=3）實驗序號菌落形成單位數(shù)（CFU）1020302.6.7辦法驗證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進行復核驗證。2.7化學穩(wěn)定性2.7.1辦法提綱層析過程中分離介質(zhì)的化學構(gòu)造直接影響選擇性和分離效果等，因此對介質(zhì)的化學穩(wěn)定性即骨架構(gòu)造有嚴格的規(guī)定。穩(wěn)定的化學性質(zhì)有助于使用者在層析和貯存過程中選擇更廣泛的實驗條件。對于蛋白A親和層析介質(zhì)來說，骨架構(gòu)造的降解、配基的脫落等這些構(gòu)造方面的不穩(wěn)定性，不僅影響介質(zhì)的使用壽命，還會對目的產(chǎn)物的純度產(chǎn)生致命的影響[9-11]。以常見分離體系的溶液pH為評價范疇，采用恒溫加速實驗方式，對蛋白A親和層析介質(zhì)開展貯存實驗，以骨架降解重要產(chǎn)物即羥甲基糠醛的絕對質(zhì)量及相對質(zhì)量比例為評價指標，對介質(zhì)在這些pH范疇內(nèi)溶液中的穩(wěn)定性狀況進行測定。其中，羥甲基糠醛的檢測辦法參考國標GB/T18932.18-《蜂蜜中羥甲基糠醛含量的測定辦法液相色譜法——紫外檢測法》和中華人民共和國出入境檢查檢疫行業(yè)原則SN/T4675.8-《出口葡萄酒中5-羥甲基糠醛的測定液相色譜法》進行。2.7.2試劑和材料實驗用水應符合GB/T6682-1992中一級規(guī)定。恒溫箱（±0.5℃）。砂芯漏斗為G3（4.5-9μm）。真空泵極限真空0.1MPa。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。高效液相色譜儀（配有紫外檢測器）。分析天平精度0.1mg。容量瓶100mL和1000mL。注射器10mL。過濾膜0.45μm。甲醇系色譜純。羥甲基糠醛純度≥99%。鹽酸、硼酸、氫氧化鈉均為分析純。2.7.3原則溶液配制原則儲藏溶液：精確稱取適量的羥甲基糠醛原則物質(zhì)于100mL容量瓶，用10mL甲醇溶解，定容，配成0.20mg/mL的原則儲藏液。此溶液可在溫度低于4℃冰箱中冷藏保存兩個月。原則工作溶液：分別吸取適量的羥甲基糠醛原則儲藏溶液至100mL容量瓶中，用10%甲醇溶液稀釋至刻度，配成0.01μg/mL、0.03μg/mL、0.05μg/mL、0.08μg/mL、0.10μg/mL，0.20μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL，4.0μg/mL，6.0μg/mL，10μg/mL原則工作溶液。當天新鮮配制。2.7.4樣品前解決辦法同2.1.3。2.7.5樣品貯存加速實驗取若干份1.00g抽干白球置于帶蓋玻璃試管內(nèi)。將上述pH3、pH13的溶液各10mL分別置于各試管內(nèi)，平行實驗三次。樣品管在40°C條件下培養(yǎng)7天。7天后，上層清液被轉(zhuǎn)移到干凈的試管內(nèi)。2.7.6上機前樣品解決1）樣品解決辦法的擬定瓊脂糖凝膠的降解辦法重要有化學降解、物理降解和酶降解，其中酸降解屬于化學降解。相比于其它降解辦法，酸降解現(xiàn)在仍是應用最廣泛的辦法，該辦法相對簡樸、成本低，可使用的酸涉及固態(tài)酸、檸檬酸、鹽酸、硫酸和醋酸等。對于蛋白A親和層析介質(zhì)來說，由于交聯(lián)作用，凝膠骨架較為穩(wěn)定，因此采用濃鹽酸或濃硫酸提高降解效率。2）樣品解決上層清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（60℃，50轉(zhuǎn)/分），定容至2mL，加入等體積12M鹽酸，100℃水解1h。定容至5mL。另取1.00g抽干白球，加入4mL6M鹽酸，100℃水解1h。定容至5mL。用0.45μm的濾膜過濾，濾液用于液相色譜儀紫外檢測器測定。2.7.7色譜測定1）色譜條件的擬定羥甲基糠醛的測定辦法有比色法、紫外分光光度法和液相色譜法。其中，液相色譜法已經(jīng)作為國標成為測定羥甲基糠醛的重要辦法。與其它兩種辦法相比，液相色譜法受干擾小，成果更為精確。色譜柱和色譜條件都是按照液相色譜實驗中最常見的操作條件進行選擇，即色譜柱選擇DiamonsilC185μm，250mm×4.6mm（i.d.）或相稱者，流動相是10%甲醇水溶液（甲醇：水=10：90）。流速1.0mL/min。檢測波長285nm。柱溫30℃。進樣量10μL。2）原則曲線的繪制在上述色譜條件下對原則工作溶液進行檢測，以保存時間對樣品進行定性，工作曲線外標法對樣品進行定量。測定原則工作溶液在上述色譜條件下的峰面積，以峰面積對對應濃度繪制原則工作曲線，羥甲基糠醛的參考保存時間為9.79-10.40min范疇內(nèi)，保存時間隨樣品濃度變化而變化濃度越低保存時間越小。羥甲基糠醛原則物質(zhì)色譜圖見圖7。aabb圖7羥甲基糠醛原則物質(zhì)色譜圖2）液相色譜測定在上述色譜條件下對未知樣品進行檢測，測定樣品的峰面積，用原則工作曲線對樣品進行定量。樣品溶液中羥甲基糠醛的響應值應在儀器的線性范疇內(nèi)。在上述色譜條件下，羥甲基糠醛的參考保存時間約為9.7-10.25min。含有羥甲基糠醛的樣品色譜圖見圖8。圖8含有羥甲基糠醛的樣品色譜圖3）空白實驗除不加樣品試液外，均按上述環(huán)節(jié)進行。2.7.8成果表達上清液中的羥甲基糠醛的含量按下式計算獲得，計算成果應扣除空白值。X=C×VV式中：X——不同pH試樣中羥甲基糠醛的含量，單位是毫克每升（mg/L）；c——從工作曲線求得的試樣溶液中羥甲基糠醛的含量，單位是毫克每升（mg/L）；V——試樣最后的定容體積，單位為毫升（mL）；V0——試樣的取樣體積，單位是毫升（mL）.介質(zhì)在不同pH溶液中的脫落率按下式計算獲得。Y=X——不同pH試樣中羥甲基糠醛的含量，單位是毫克每升（mg/L）；X0——抽干白球試樣中羥甲基糠醛的含量，單位是毫克每升（mg/L）；計算成果用平行測定的算數(shù)平均值表達，保存兩位有效數(shù)字。2.7.9定量限本辦法的定量限為0.01mg/L。2.7.10允許差同一試樣三次測定成果之差，應不超出平均值的10%。pH=3條件下：表6精密度實驗（n=3）實驗序號羥甲基糠醛含量（mg/L）介質(zhì)脫落率（%）10.011050.05020.012610.05730.012110.055x0.011920.054s0.000650.0036RSD(%)5.456.68pH=13條件下：表7精密度實驗（n=3）實驗序號羥甲基糠醛含量（mg/L）介質(zhì)脫落率（%）10.009480.04020.008580.03630.009750.041x0.009270.039s0.000610.0026RSD(%)6.616.782.7.11辦法驗證為了擬定檢查辦法，原則起草單位已委托三家單位對辦法進行復核驗證。五、重要工作過程1、構(gòu)成原則起草小組原則制訂任務下達后，原則制訂單位中國科學院過程工程研究所和中國原則化研究院構(gòu)成了原則起草小組，本原則重要起草人：黃永東、趙嵐、朱凱、吳學星、馬光輝、蘇志國、馬愛進。2、開展有關調(diào)研狀況為了更加好地制訂《瓊脂糖分離介質(zhì)》國標，原則起草小組完畢了國內(nèi)外有關資料的收集、整頓、分析，現(xiàn)在國內(nèi)沒有瓊脂糖分離介質(zhì)的國標，現(xiàn)有針對離子交換樹脂的有關原則，如：GBT5758-離子交換樹脂粒度、有效粒徑和均一系數(shù)的測定；GBT13659-001×7強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂；GBT13660-201×7強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂；GBT5757-離子交換樹脂含水量測定辦法等，由于離子交換樹脂系硬樹脂，其理化性質(zhì)與瓊脂糖分離介質(zhì)差別很大，因此有關國標和對應的測定辦法也不合用。初步制訂了瓊脂糖分離介質(zhì)理化性質(zhì)檢測內(nèi)容和研究辦法。3、原則起草完善過程根據(jù)GB/T1.1—《原則化工作導則第1部分：原則的構(gòu)造和編寫規(guī)則》、GB/T1.2—《原則化工作導則第2部分：原則中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的擬定辦法》等原則編制規(guī)定，對《瓊脂糖分離介質(zhì)》原則開展了研制工作，瓊脂糖分離介質(zhì)原則起草工作小組完畢了《瓊脂糖分離介質(zhì)》國標（草案）。具體時間及所做工作涉及以下：7月，項目正式啟動；7月至12月，制訂瓊脂糖分離介質(zhì)理化性質(zhì)初步研究方案；1月，召開原則草案實施方案論證會，報告草案初步方案，聽取專家建議；1月至4月，制訂瓊脂糖分離介質(zhì)理化性質(zhì)檢測方案，擬定需要測定的若干理化性質(zhì)，準備有關實驗材料，研究樣品前解決條件，初步建立各檢測辦法。在這些工作中我們不?？偨Y(jié)經(jīng)驗，對瓊脂糖分離介質(zhì)進行了大量的測定工作，優(yōu)化檢測內(nèi)容，改善檢測辦法，并對辦法檢測精密度進行實驗等。在此基礎上，5月征求了專家意見，起草組按照專家意見對原則內(nèi)容進行了修改完善，形成了原則征求意見稿。六、辦法驗證及成果本原則征求意見稿中檢測辦法的驗證工作，已委托北京理化分析測試中心、北京林業(yè)大學、中科森輝微球技術(shù)（蘇州）有限公司進行驗證。三家單位的驗證成果表明本原則中的檢測辦法可行、成果可靠，各項檢測指標和原則偏差都滿足原則草案所規(guī)定的數(shù)值和范疇。七、與有關的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性國標的關系本原則符合國家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強制性國標的規(guī)定，本原則有助于《中華人民共和國產(chǎn)品質(zhì)量法》等有關法律、法規(guī)、規(guī)章和強制性國標的實施。本原則的實施不涉及對現(xiàn)行原則的廢止狀況。八、原則屬性的建議本原則屬于基礎管理原則，建議作為推薦性原則同意公布。九、貫徹國標的規(guī)定和方法建議在該原則公布后，建議有關的管理部門及時組織各級質(zhì)量監(jiān)督檢查機構(gòu)的質(zhì)量檢查人員進行交流和培訓，使其純熟掌握瓊脂糖分離介質(zhì)理化性質(zhì)的測定辦法，然后推薦到海洋生物產(chǎn)品質(zhì)量控制與檢測中使用。

參考文獻[1]馬光輝,蘇志國.高分子微球材料[M].化學工業(yè)出版社,.[2]ZhouQZ,WangLY,MaGH,etal.Preparationofuniform-sizedagarosebeadsbymicroporousmembraneemulsificationtechnique.JournalofColloidandInterface