第二章 生物樣品的制備

第二章生物樣品的制備目錄2.1生物分析化學(xué)分析對象的復(fù)雜性2.2生物材料的選擇2.3激光捕獲顯微切割技術(shù)2.4細(xì)胞的破碎2.5生物大分子提取2.6生物大分子的分離與純化2.7固相萃取與固相微萃取分析對象：生物大分子----蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖生物小分子----具有生物活性的小分子化合物（內(nèi)源性小分子、外源性小分子）復(fù)雜性：組成、含量、動力學(xué)范圍、時空依存性2.1生物分析化學(xué)分析對象的復(fù)雜性2.1生物分析化學(xué)分析對象的復(fù)雜性生物分析化學(xué)的樣品制備特點：（1）生物樣品的組成極其復(fù)雜（2）許多生物分子的含量極微（3）具有很寬的動力學(xué)濃度范圍（4）提取制備過程中極易失活（5）實驗結(jié)果易受操作的影響制備生物分子的基本原則：（1）確定要制備的生物分子的目的和要求（2）掌握目標(biāo)產(chǎn)物的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)（3）生物材料的破碎和預(yù)處理（4）分離純化方案的選擇和探索（5）選擇相應(yīng)、可靠的分析技術(shù)（6）產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存樣品處理需要考慮的生物分子的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)：（1）在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解度（2）在不同溫度、pH的溶液和各種緩沖液中的穩(wěn)定性（3）固態(tài)時對溫度、含水量和凍干時的穩(wěn)定性（4）各種物理性質(zhì)—分子大小、穿膜能力、帶點情況、離心沉降表現(xiàn)（5）化學(xué)性質(zhì)—對各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性（6）對其他生物分子的親和力（7）在細(xì)胞內(nèi)的定位等分離純化基本原理：利用混合物中幾個組分分配系數(shù)的差異物理力場2.2生物材料的選擇生物材料來源于動物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物，應(yīng)盡可能選擇含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低的生物材料。植物材料：季節(jié)性、地理位置、生長環(huán)境動物材料：年齡、性別、營養(yǎng)狀況、遺傳因素、生理狀態(tài)微生物：菌種代數(shù)、培養(yǎng)基成分之間的差異材料選定后加工處理：動物組織：去結(jié)締組織、脂肪、破碎細(xì)胞植物：去殼、除脂微生物：菌體與發(fā)酵液分開生物材料-----冰凍保存2.3激光捕獲顯微切割技術(shù)激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）是在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下通過顯微操作系統(tǒng)對欲選取的材料（組織、細(xì)胞群、細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)組分或染色體區(qū)帶等）進(jìn)行切割、分離，獲取均勻性很好的目標(biāo)細(xì)胞，以用于后續(xù)研究的顯微分離收集技術(shù)。2.3.1LCM的特點（1）LCM可以從任何組織中快速、精確地分離出純的特異細(xì)胞及細(xì)胞群。（2）利用顯微切割技術(shù)實在組織細(xì)胞或染色體的原位取材，因此，所取材料的定位清楚，所研究對象的歷史背景明確。（3）顯微切割技術(shù)可以保證所取材料在一定層次上的同質(zhì)性。（4）LCM可以與多種分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病理

學(xué)技術(shù)結(jié)合使用。2.3.2LCM的儀器與操作1.

PixCellIIeLCMSystem倒置顯微鏡，光束不動，載物臺移動，激光逐點打到樣品區(qū)2.LaserMicro-Dissection正置顯微鏡，紫外激光束自動掃描切割樣品邊緣LCM切割原理圖LCM實例與應(yīng)用廣泛應(yīng)用于各種腫瘤研究A：正常細(xì)胞;B：腺瘤;C：癌組織。

激光顯微捕獲大腸癌細(xì)胞1：H&E染色(20倍放大);2：LCM前Hematoxylin染色;3：LCM后Hematoxylin染色;4：切割下的上皮細(xì)胞。2.4細(xì)胞的破碎細(xì)胞破碎方法劇烈程度應(yīng)用對象機(jī)械法研磨法溫和固體組織細(xì)胞、微生物細(xì)胞組織搗碎法（勻漿法）劇烈固體組織細(xì)胞、微生物細(xì)胞物理法反復(fù)凍融法溫和細(xì)菌細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞超聲波處理法劇烈懸浮細(xì)胞壓榨法劇烈微生物細(xì)胞、含有細(xì)胞壁的細(xì)胞冷熱交替法溫和細(xì)菌細(xì)胞或病毒化學(xué)與生物化學(xué)方法自溶法溫和組織及各種細(xì)胞溶脹法溫和血細(xì)胞、組織培養(yǎng)細(xì)胞酶解法溫和植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞各種細(xì)胞破碎方法的應(yīng)用范圍2.5生物大分子的提取2.5.1水溶液提取影響因素鹽濃度（離子強(qiáng)度）pH溫度防止降解作用攪拌與氧化2.5.2有機(jī)溶劑提取對于一些難溶的蛋白質(zhì)和酶，常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。常用有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等。

有些蛋白質(zhì)和酶既能溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機(jī)溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼有去除雜質(zhì)、提高純化效果的作用。2.6生物大分子的分離與純化2.6.1離心技術(shù)（centrifugetechnique）離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在作迅速圓周運(yùn)動時受到一個外向的離心力的行為為發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。具有比較溫和、分離樣品量大等特點。1離心作用是根據(jù)在一定角速度下作圓周運(yùn)動的任務(wù)物體都受到一個向外的離心力進(jìn)行的。相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）：RCF=F離心力/F重力離心力與相對離心力沉降系數(shù)S：顆粒在單位離心力作用下的陳啊靜速度稱該顆粒的沉降系數(shù)。斯維得貝格單位（Svedbergunit）:10-13S沉降速度：

在強(qiáng)大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動的距離。K系數(shù)：

用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。2沉降系數(shù)、沉降速度、K系數(shù)1）差速離心法---不同粒子在離心力場沉降的差別粗制品提取2）速率區(qū)帶離心法---粒子在梯度液中沉降系數(shù)不同3）等密度離心法---粒子顆粒密度不同3離心技術(shù)的分類理想梯度材料特點：完全惰性，易分離黏度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和pH變化較小無腐蝕作用易純化，成本低濃度便于測定物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)已知4梯度溶液的制備梯度材料的應(yīng)用介質(zhì)DNARNA核蛋白膜細(xì)胞器細(xì)胞病毒蔗糖--++++++++聚蔗糖----+++++++氯化銫++++++---++Percoll---++++++碘化物+++++++++++++++沉淀是溶質(zhì)從溶液中析出的過程。操作簡便、成本低原理：根據(jù)不同溶質(zhì)在溶劑中溶解度不同從而使其分離通過沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相。2.6.2沉淀法1中性鹽沉淀（鹽析法）中性鹽的選擇—硫酸銨鹽析的操作方法—固體硫酸銨加入法鹽析的影響因素蛋白質(zhì)的濃度pH溫度2有機(jī)溶劑沉淀法基本原理：降低水溶液的介電系數(shù)有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計算—乙醇、甲醇、丙酮V=V0(S2-S1)/(100-S2)影響因素溫度樣品濃度pH離子強(qiáng)度3選擇性變性沉淀法熱變性有機(jī)溶劑變性非目的物變性沉淀選擇性酸堿變性4等電點沉淀法：利用具有不同等電點的良性電解質(zhì)在達(dá)到中性時溶解度最低，易發(fā)生沉淀的性質(zhì)，從而實現(xiàn)分離的方法5有機(jī)聚合物沉淀法：早起應(yīng)用于提純免疫球蛋白及沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來應(yīng)用于核酸和酶的純化。PEG沉淀解釋