第五章 植物細胞工程制藥

第五章植物細胞工程制藥5.1概述5.2植物細胞的形態(tài)和生理特性5.3植物細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)5.4影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素5.5植物細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器5.6進展與展望5.7植物生物轉(zhuǎn)化與生物制藥5.1概述高等植物次級代謝產(chǎn)物極其豐富多樣，除藥用之外，許多次級代謝產(chǎn)物還是食品、化工和農(nóng)業(yè)化學的重要原料。人們通過研究，一方面通過化學合成的方法來生產(chǎn)，另一方面通過植物細胞培養(yǎng)方法來生產(chǎn)。目前已經(jīng)研究過的近300種植物細胞培養(yǎng)物可以生產(chǎn)400多種人們感興趣的成分。5.1.1基本概念植物組織和細胞培養(yǎng)：是指在無菌和人工控制的營養(yǎng)（培養(yǎng)基）及環(huán)境條件（光照、溫度等）下，研究植物的細胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。幼苗及較大植株的培養(yǎng)，即為植物培養(yǎng)（plantculture）；從植物各種器官的外植體增殖而形成的愈傷組織的培養(yǎng)叫做愈傷組織培養(yǎng)（callusculture）；能夠保持較好分散性的離體細胞或較小細胞團的液體培養(yǎng)，稱為懸浮培養(yǎng)（suspensionculture）；離體器官的培養(yǎng)，如莖尖、根尖、葉片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果實的培養(yǎng)，稱為器官培養(yǎng)（organculture）；未成熟或成熟的胚胎的離體培養(yǎng)，則稱為胚胎培養(yǎng)（embryoculture）。植物無菌培養(yǎng)技術(shù)分類懸浮培養(yǎng)是指在液體培養(yǎng)基中，能夠保持良好分散性的細胞和小的細胞聚集體的培養(yǎng)。在此培養(yǎng)條件下組織化水平較低。細胞培養(yǎng)是指利用單個細胞進行液體或固體培養(yǎng)，誘導其增殖及分化。其目的是為了得到單細胞無性繁殖系。分生組織培養(yǎng)（meristemculture）又稱生長錐培養(yǎng)，是指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細胞。分生組織，如莖尖分生組織的部位僅限于頂端圓錐區(qū)，其長度不超過0.1mm。研究表明，通過組織培養(yǎng)技術(shù)進行植物的快速繁殖試驗時往往并沒有利用這么小的外植體，而是利用較大的莖尖組織，通常包括1~2個葉原基。外植體（explant）是指用于植物組織（細胞）培養(yǎng)的器官或組織（的切段），植物的各部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進行組織培養(yǎng)。器官形成（organogenesis）是指在組織培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)物中芽、根或花等器官的分化與形成?；蛘咴谙刃纬傻男「垦杆傩纬捎鷤M織，然后再形成芽；或者在不同部位分別形成芽或根之后，再形成維管組織而將二者連成一個軸，最后形成小植株。如果培養(yǎng)過程中小植株的發(fā)生途徑與正常的受精卵發(fā)育方式極為近似時，通常稱為胚胎形成（embryogenesis）。當在體細胞或花藥培養(yǎng)中培養(yǎng)物是小孢子這樣的單倍體細胞，其所形成的胚胎結(jié)構(gòu)叫做“胚狀體”（embryoid，orembryo-like）或“不定胚”（adventitiousembryo）。無性繁殖系無性繁殖系（clone）又叫克隆，是指使用母體培養(yǎng)物反復進行繼代培養(yǎng)時，通過同種外植體而獲得越來越多的無性繁殖后代而言，如根無性系、組織無性系、懸浮培養(yǎng)物無性系等。在上述無性系的培養(yǎng)中，有時其局部的組織無論在結(jié)構(gòu)、生長速度以及顏色方面都表現(xiàn)出明顯的區(qū)別，如繼續(xù)進行選擇培養(yǎng)，則從同一無性系可分離形成二個或多個不同的系列，該系列稱為“無性系的變異體”（clonalvariant）。突變體細胞本身發(fā)生遺傳變異或應(yīng)用誘變處理發(fā)生的遺傳變異所得的新細胞，即為突變體（mutant）。由單細胞形成的無性系稱為“單細胞無性系”；如果這種單細胞無性系是從同一組織分離得到的，并彼此不同時，叫做“單細胞變異體”。繼代培養(yǎng)由最初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”。連續(xù)多代的培養(yǎng)即為“繼代培養(yǎng)”（subculture），又稱“連續(xù)培養(yǎng)”。但習慣上“連續(xù)培養(yǎng)”一詞多用于不斷加入新的培養(yǎng)基，并連續(xù)收集培養(yǎng)物以保持平衡而進行的長期不轉(zhuǎn)移的懸浮培養(yǎng)。次級代謝和次級代謝產(chǎn)物人們把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白質(zhì)及糖類（這些成分通常稱為初級代謝產(chǎn)物）以外，具有如下特征的成分稱為次級代謝產(chǎn)物：①有明顯的分類學區(qū)域界限；②其合成需在一定的條件下才能發(fā)生；③缺乏明確的生理功能；④是生命的多余成分。現(xiàn)代定義：次級代謝作用是特殊蛋白質(zhì)內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合體現(xiàn)。上述作用的結(jié)果導致了次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，如生物堿、黃酮體、萜類、有機酸、木質(zhì)素等。5.1.2植物細胞培養(yǎng)發(fā)展簡史19世紀上半葉，Schleiden和Schwann提出了細胞學說；20世紀初，德國著名植物學家Haberlandt依據(jù)細胞理論，首次提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至單個細胞的觀點；20世紀20年代初至30年代，在胚胎培養(yǎng)和器官培養(yǎng)領(lǐng)域中取得了一些成果。Hanning首次在無機鹽溶液及有機營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，觀察到離體胚均能正常發(fā)育，同時發(fā)現(xiàn)有促進提早萌發(fā)成苗的事實。自此植物器官與營養(yǎng)需求之間關(guān)系研究、原生質(zhì)體、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法的研究獲得了高度重視，基因工程技術(shù)也被用于植物次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中。5.2植物細胞的形態(tài)和生理特性5.2.1植物細胞的形態(tài)植物細胞的形態(tài)多種多樣，隨植物種類、存在部位和功能的不同而異。游離的或排列疏松的薄壁細胞多呈球形、類圓形和橢圓形；排列緊密的細胞多呈角形；具有支持作用的細胞，細胞壁常增厚，呈類圓形、紡錘形等；具有輸導作用的細胞則多呈管狀。植物細胞大小不一。植物基本組織細胞體積較大，種子植物薄壁細胞的直徑在20~100微米之間；儲藏組織細胞的直徑可達1mm。苧麻纖維一般為200mm，有的可達500mm以上。最長的細胞是無節(jié)乳管，長達數(shù)米至數(shù)十米不等。5.2.2植物細胞結(jié)構(gòu)特征根據(jù)典型細胞核的有無可將生物細胞分為原核細胞（prokaryoticcell）和真核細胞（eukaryoticcell）。真核細胞有典型的、為雙層膜所包被著的細胞核，原核細胞中只有類核（nucleoid）。類核沒有核膜包被，常常只有一條DNA，其周圍即為細胞質(zhì)。高等植物的細胞均為真核細胞。與動物細胞及微生物細胞相比，植物細胞有3個特點，即具有細胞壁、液泡和質(zhì)體（如葉綠體）。5.2.3細胞后含物和生理活性物質(zhì)細胞中除含有生命的原生質(zhì)體外，還有許多非生命的物質(zhì)，它們均為細胞代謝過程中的產(chǎn)物。后含物：系儲藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)，分布于液泡內(nèi)，如糖類（saccharide）、鹽類（salts）、生物堿、苷、有機酸、揮發(fā)油等；生理活性物質(zhì)：對細胞內(nèi)生化代謝和生理活動起著調(diào)節(jié)作用，含量雖少，但其生理作用卻非常重要，如酶、維生素、植物激素和抗生素等。生物堿（alkaloide）是一類含氮的有機化合物，廣布于植物界。含生物堿較多的植物科有：茄科、罌粟科、小檗科、豆科、夾竹桃科等。按照植物化學分類學的觀點，親緣關(guān)系相近的植物，常含有化學結(jié)構(gòu)相似的成分。此外，一種植物所含的同一類成分中也經(jīng)常存在多種化學成分，如人參中含有幾十種人參皂苷。它們均屬于三萜皂苷類成分。中草藥中含有多種生物堿，如麻黃堿、咖啡、阿托品、喹啉、黃連素等，其生理活性都很強。細胞后含物糖苷類糖苷（glucosides）是指某些有機化合物和糖經(jīng)苷鍵結(jié)合而成的化合物，例如黃酮苷是黃酮苷元和糖連接而成。很多糖苷類化合物對疾病都有很好的治療作用，如洋地黃毒苷有強心作用；大黃中的蒽醌苷有強烈的瀉下作用；紫草中紫草寧是紫草中蒽醌類化合物的總稱，除作為天然色素（如口紅）外，尚具有很好的抗癌活性。揮發(fā)油（volatileoil）是一類具有芳香氣味，在常溫下易于揮發(fā)的油類。在傘形科、姜科、唇形科等植物中多有分布。很多揮發(fā)油可作藥用，如薄荷油、丁香油、桉油等。有機酸（organicacids）是糖類代謝的中間產(chǎn)物。植物果實中酸味以及細胞液的酸性反應(yīng)，主要是由于有機酸的存在。常見的植物有機酸有：蘋果酸、檸檬酸、水楊酸、酒石酸等。生理活性物質(zhì)是一類對細胞內(nèi)的生化反應(yīng)和生理活動起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)的總稱。包括酶、維生素、植物激素和抗生素等。酶（enzymes）是一種有機催化劑。酶反應(yīng)一般在常溫、常壓、中性水溶液中進行，高溫、強酸、強堿和某些重金屬離子，會使其失活。維生素是一類復雜的有機物，常參與酶的形成，對植物的生長、呼吸和物質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用，如對難以生根的植物，用維生素B12處理后可促進不定根的生長。植物激素是植物細胞原生質(zhì)體產(chǎn)生的一類復雜的調(diào)節(jié)代謝的有機物質(zhì)，對生理過程（如細胞分裂和繁殖）產(chǎn)生作用，其量雖微，但作用甚大。抗生素和植物殺菌素是由微生物（如某些菌類植物）產(chǎn)生的能殺死或抑制某些微生物生長的物質(zhì)，如青霉素、鏈霉素等。高等植物如蔥、蒜、辣椒、蘿卜等也能產(chǎn)生殺菌的物質(zhì)，稱為植物殺菌素（plantfungicidin）。5.2.4植物培養(yǎng)細胞的生理特性延遲期（lagphase）植物培養(yǎng)細胞不同生長階段的持續(xù)時間及特征。細胞分裂的初始期和最大生長期之間，其持續(xù)時間取決于培養(yǎng)前的條件、時期和培養(yǎng)基性質(zhì)，其特征是細胞數(shù)量、干重近乎恒定，細胞壁厚度達最大；高RNA含量；高蛋白質(zhì)合成能力；高聚核糖體含量；有絲分裂加速；增加細胞的細胞質(zhì)部分加速期（accelerationphase）細胞最大生長期和最大細胞濃度，最佳DNA濃度和蛋白質(zhì)累積率，持續(xù)時間3~4代，其特征為常數(shù)：干重增加：細胞數(shù)、DNA和蛋白質(zhì)濃度減少：有絲分裂活性、RNA含量和蛋白質(zhì)合成能力、增加細胞鮮種、干重及RNA酶活性。對數(shù)期（logphase）：介于最大生長率和蛋白質(zhì)合成完全停止期之間，其特征為蛋白質(zhì)合成能力減退；變化：聚核糖體濃度向有利于單核糖體和寡核糖體形成的方向減少。穩(wěn)定期（stationaryphase）：細胞數(shù)穩(wěn)定，其特征為細胞高液泡化、極度脆弱、高度分化，有機化合物的濃度高。植物細胞培養(yǎng)存在問題植物培養(yǎng)細胞重量的增加主要取決于對數(shù)期，而次級代謝產(chǎn)物的累積則主要在穩(wěn)定期完成。當然植物細胞與哺乳動物細胞及微生物細胞有很多的不容，并由此導致了一系列生理生化等方面的差異，比如混合與傳質(zhì)等。就植物細胞而言，它們很少以單一細胞懸浮生長，而多以非均相集合體的細胞團形式存在。根據(jù)細胞系的來源、培養(yǎng)基及培養(yǎng)時間等的不同，細胞團的細胞數(shù)目在2~200之間，直徑為2mm左右。細胞團產(chǎn)生原因：（1）細胞分裂之后沒有進行細胞分離；（2）在間歇培養(yǎng)過程中細胞處于對數(shù)生長后期時，開始分泌粘多糖和蛋白質(zhì)，或者以其它形式形成粘性表面，從而形成細胞團。植物細胞形態(tài)上的另一特性，就是其纖維素細胞壁使得其外骨架相當脆弱，表現(xiàn)為抗張力強度大，抗剪切能力小，故傳統(tǒng)的攪拌式生物反應(yīng)器容易損壞植物細胞的細胞壁。再者，植物細胞培養(yǎng)基黏度比較高，且培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量呈指數(shù)上升。所有的植物都是好氣性的，因此培養(yǎng)過程中需要不斷地供氧。但是，與微生物細胞相反，它并不需要很高的氣液傳質(zhì)速率，而是要控制供氧量，以保持較低的溶氧水平。此外，大多數(shù)植物細胞液體培養(yǎng)的pH為5~7，在此pH水平，通氣速率過高會驅(qū)除二氧化碳而抑制細胞生長，這個問題可通過在通氣過程中加入一定濃度的二氧化碳來解決。注意光照的影響。植物細胞液體培養(yǎng)過程中的泡沫問題不象微生物細胞培養(yǎng)時那么嚴重，泡沫的性質(zhì)也不同。氣泡比微生物培養(yǎng)系統(tǒng)中的大，而且由于其含有蛋白質(zhì)或粘多糖，黏度較大，細胞極易被包埋在泡沫中，并從循環(huán)的營養(yǎng)液中帶出來，這就造成了非均相培養(yǎng)，通常需要采用化學或機械的方法加以控制，否則，隨著泡沫和細胞數(shù)量的增加，混合和培養(yǎng)過程的穩(wěn)定性就要受到影響。在植物細胞液體培養(yǎng)過程中，細胞可能會黏附于培養(yǎng)的反應(yīng)器壁、電極或擋板的表面上。細胞對表面的黏附及其在器壁上的生長特性，是人們目前正在研究的重點課題之一。通過改變培養(yǎng)基中某些離子的成分，可使表面吸附問題得到一定程度的改善。5.3植物細胞培養(yǎng)基本技術(shù)5.3.1植物材料準備用于植物組織培養(yǎng)的外植體，必須是無雜菌材料。微生物在接觸培養(yǎng)基時會大量繁殖，抑制培養(yǎng)物的生長，因此需滅菌處理。許多化學試劑均能作為表面滅菌劑使用，原則上應(yīng)盡可能選擇那些滅菌后易于除去或容易分解的時間試劑。滅菌劑的選擇和處理時間的長短取決于所用材料對試劑的敏感性。對滅菌劑敏感的外植體的滅菌時間不宜過長；而不敏感的，滅菌時間則可適當延長。經(jīng)常使用的滅菌劑如下表。常用滅菌劑效果比較滅菌劑使用濃度/%去除難易程度滅菌時間/min效果次氯酸鈣次氯酸鈉過氧化氫溴水硝酸銀氯化汞抗生素9~100.5~53~121~210.1~14~50mg/L易易最易易較難較難中5~305~305~152~105~302~1030~60很好很好好很好好最好較好植物不同組織（器官）的滅菌時間和步驟組織（器官）滅菌步驟備注滅菌前處理滅菌滅菌后處理種子果實莖切段儲藏器官葉片純酒精中浸10min，再用無菌水漂洗純酒精漂洗自來水洗凈，再用酒精洗自來水自來水，吸干，純酒精100g/L次氯酸鈣浸20~30min，再用10g/L溴水浸5min20g/L次氯酸鈉浸10min20g/L次氯酸鈉浸5~30min20g/L次氯酸鈉浸20~30min1g/L氯化汞浸1min無菌水洗3次，在無菌水中發(fā)芽；或無菌水洗5次，在濕無菌紙上發(fā)芽無菌水沖洗，再剖除內(nèi)部組織的種子無菌水洗3次無菌水洗3次，濾紙吸干無菌水反復沖洗，濾紙吸干用幼根或幼芽發(fā)生愈傷組織獲得無菌苗選取嫩葉、葉片平放在瓊脂上植物材料滅菌后，即可進行培養(yǎng)。接種的外植體的形狀和大小要根據(jù)試驗?zāi)康募熬唧w情況而定。當然，如果所用外植體細胞多時，得到愈傷組織的機會必然也多。如要定量研究愈傷組織，則不僅外植體的大小要一致，而且其形狀及組織部位也應(yīng)基本類似。進行這類培養(yǎng)研究常常選用較大材料，如人參、胡蘿卜或甜菜的貯藏根、馬鈴薯的塊莖等。5.3.2培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基實際上是植物離體器官、組織或細胞等的無菌土壤，其特點是營養(yǎng)成分的可調(diào)控性。植物組織和細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基種類較多，但通常都含有無機鹽、碳源、有機氮源、植物生長激素、維生素等化學成分。有商品化的培養(yǎng)基可以購買。無機鹽基本培養(yǎng)基是由各種濃度的無機鹽溶液組成的，這些無機鹽又有“大量元素”和“微量元素”之分。大量元素是指使用濃度大于30mg/L時的無機元素，包括N、S、P、K、Mg、Ca、Cl和鈉，而微量元素是指濃度低于30mg/L的無機元素，如Fe、B、Mn、I和Mo，以及極微量的Cu和Zn。某些情況下，還可加入Ni、Co和Al。這些微量元素作為輔因子或?qū)γ负铣啥裕际潜仨毜?，如鎳對脲酶的合成就是至關(guān)重要的。碳源植物細胞培養(yǎng)物通常均為異養(yǎng)細胞。因此人們經(jīng)常使用碳水化合物、肌醇作為碳源，有時也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。有些培養(yǎng)物還可通過同化二氧化碳而獲得所需的能量，此所謂光自養(yǎng)培養(yǎng)物。在某些情況下，培養(yǎng)基固化劑也可作為補充能量和碳源之用。此外，某些天然提取物對愈傷組織的誘導和培養(yǎng)也有重要意義，如椰子乳（椰子的液體胚乳），常用濃度為10%；也可用0.5%的酵母提取物或5%~10%的番茄汁等。植物生長調(diào)節(jié)劑植物激素是指植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（<1M）時即能調(diào)節(jié)植物的生育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運到作用部位而發(fā)揮作用。植物激素只限于天然產(chǎn)生的調(diào)節(jié)物質(zhì)，到目前位置，已發(fā)現(xiàn)植物組織中可以形成5種植物激素，即生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯。植物生長調(diào)節(jié)劑既包括人工合成的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以及植物激素。有機氮源多為蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（如谷氨酰胺）或各種氨基酸。有機氮源對細胞的早期生長有利，氨基酸的加入主要是為了代替或增加氮源的供應(yīng)，但應(yīng)注意的是蘇氨酸、甘氨酸和纈氨酸可通過滅活位于葉綠體和細胞質(zhì)上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有補償此滅活作用的能力。維生素植物細胞通常是維生素自養(yǎng)型的，但在大多數(shù)情況下，其自身合成的量均不能滿足植物細胞的需要，即使是光合成活性細胞或組織也是如此。故對大多數(shù)培養(yǎng)基而言，除了必需加入的B族維生素（如B1、B6和泛酸）外，通常還需加入一定量的生物素和肌醇，后者是構(gòu)成磷酸肌醇（細胞膜脂質(zhì)部分含磷酸肌醇2%~8%）極性端的部分。5.3.4培養(yǎng)方法按培養(yǎng)對象：原生質(zhì)體培養(yǎng)、單倍體細胞培養(yǎng)；按照培養(yǎng)基類型：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式：懸浮細胞培養(yǎng)、固定化細胞培養(yǎng)。固體培養(yǎng)是在微生物培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。所謂固體培養(yǎng)系統(tǒng)實際上包括利用瓊脂作為支撐物的固體培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝入培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)的特點是簡便易行、所占空間小。但也有缺點，主要是不均衡現(xiàn)象。常用的固化劑有瓊脂、藻酸鹽（alginate）、角叉藻聚糖（carrageenan）、明膠（gelatin）、羥乙基纖維素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅膠等。最常用的凝固劑是瓊脂，最適濃度0.6~1.0%。溫度一般控制在251℃之間。有些植物材料在誘導愈傷組織時需要在黑暗條件下進行，但誘導愈傷組織的器官分化和其他材料的培養(yǎng)都需要光照。光照以每天16h為宜。由于植物組織在培養(yǎng)基上生長要不斷消耗營養(yǎng)、散失水分和累積代謝物，必將影響培養(yǎng)物的進一步生長。因此外植體在培養(yǎng)三周左右必須轉(zhuǎn)換至新鮮培養(yǎng)基上，以保持正常生長。移換一次培養(yǎng)基稱一次繼代培養(yǎng)。一種外植體經(jīng)過一定次數(shù)的繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)物就可用于懸浮培養(yǎng)。包括小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模的成批培養(yǎng)、半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)：靜止和振蕩兩類。靜止液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)一樣，也具有簡便易行的特點，而且培養(yǎng)基還不會產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)濃度差的現(xiàn)象。振蕩液體培養(yǎng)，是使懸浮細胞在液體培養(yǎng)基中，并不斷振動下進行培養(yǎng)。這樣可以防止上述靜止培養(yǎng)的許多缺點。通常培養(yǎng)基的體積約占容器體積的20%。液體培養(yǎng)成批培養(yǎng)法將培養(yǎng)基一次性地加入反應(yīng)器，接種、培養(yǎng)一定時間后收獲細胞的操作方式稱為成批培養(yǎng)法。植物細胞培養(yǎng)過程中，次級代謝產(chǎn)物的大量累積往往發(fā)生在細胞生長的穩(wěn)定期，人們基于此原理設(shè)計了植物細胞的兩步培養(yǎng)法，即使用兩個生物反應(yīng)器，第一個反應(yīng)器用于細胞生物量的累積，第二個反應(yīng)器用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。半連續(xù)培養(yǎng)法：在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進行交換的培養(yǎng)方法稱為半連續(xù)培養(yǎng)法。連續(xù)培養(yǎng)法：利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)一段時后，以一定速度連續(xù)采集細胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細胞生長環(huán)境長期維持恒定的方法。固定化培養(yǎng)法植物次級代謝產(chǎn)物的累積主要在細胞生長的穩(wěn)定期，表明細胞成塊而趨于分化時，細胞塊中各個細胞處于一定理化梯度之下，此現(xiàn)象與完整植株類似，由此人們提出了植物細胞固定化培養(yǎng)技術(shù)。固定化培養(yǎng)采用的固定化反應(yīng)器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中空纖維膜等多種類型，將細胞固定于尼龍?zhí)變?nèi)，或固定于中孔纖維反應(yīng)器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板上，放入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，或連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液，進行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集培養(yǎng)產(chǎn)物，也可通入凈化空氣以代替攪拌。優(yōu)點是細胞位置固定，易于獲得高密度細胞群體及維持細胞間的物理化學梯度，利于細胞組織化，易于控制條件。5.4影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；物理條件：溫度、光（光照時間、光強、光質(zhì)）、通氣（O2）、pH和滲透壓等；化學條件：無機鹽（N、P、K等）、碳源、植物生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)、前體等；工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌和培養(yǎng)方法等。因素包括5.4.1外植體不同外植體的懸浮細胞培養(yǎng)物，其最大次級代謝產(chǎn)物的累積時間各異。同一化合物可以在不同外植體的不同生長階段中累積，有的次級代謝產(chǎn)物累積是在延遲期進行，有的則在加速期累積，當然也有的累積時間與細胞生長曲線同步，還有的則在穩(wěn)定期大量累積次級代謝產(chǎn)物。5.4.2培養(yǎng)條件接種和誘導：外植體的大小不僅影響所誘導的組織和細胞的生長，而且也關(guān)系到其次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力，如長春花培養(yǎng)物中蛇根堿的合成要求其外植體直徑在1~12cm之間，在此條件下才能分泌噻吩類成分。次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外植體大小、細胞密度及營養(yǎng)成分密切相關(guān)，如在紫草的細胞培養(yǎng)中，當營養(yǎng)成分的供給為1400mg/L時，細胞干重為2.8g/L。然而，細胞生長率的增加有時會導致次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的降低。外植體的大小可能是使某些次級代謝產(chǎn)物含量發(fā)生變化的原因之一，此類現(xiàn)象常見于一些高產(chǎn)細胞株經(jīng)繼代培養(yǎng)之后。前處理也可影響累積方式。5.4.3培養(yǎng)環(huán)境基本培養(yǎng)基組成：基本培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮細胞培