第6章-第七章原核基因的表達(dá)與調(diào)控

第六章基因的表達(dá)與調(diào)控(上)原核基因表達(dá)調(diào)控模式6.1原核基因表達(dá)調(diào)控總論6.2乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)6.3色氨酸操縱子與負(fù)控阻遏系統(tǒng)6.4其他水平的調(diào)控6.1原核基因表達(dá)調(diào)控總論闡明的科學(xué)問題真核與原核生物如何調(diào)控?cái)?shù)以千、萬計(jì)的基因以最為經(jīng)濟(jì)、有效的時(shí)空模式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)、細(xì)胞的分化,組織的特化和個(gè)體的發(fā)育。隨著生物個(gè)體的發(fā)育，DNA分子能有序地將其所承載的遺傳信息，通過密碼子-反密碼子系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)，執(zhí)行各種生理生化功能?？茖W(xué)家把從DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá)（geneexpression），對(duì)這個(gè)過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控（generegulation或genecontrol）。原核生物與真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有驚人的相似性共同的起源與共同的分子基礎(chǔ)調(diào)控機(jī)理上調(diào)控層次上核酸分子間的互作核酸與蛋白質(zhì)分子間的互作蛋白質(zhì)分子間的互作transcriptionallevelpost—transcriptionalleveltranslationallevelpost—translationallevel轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟(jì),

靈活，又是最為重要，復(fù)雜的調(diào)控●在復(fù)雜的基因組內(nèi)，確定需要基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)●精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的水平,以保證生物體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)●cisfactor&transfactor間嚴(yán)格而又靈活的互作●保證RNApolymerase的進(jìn)行式轉(zhuǎn)錄（不中斷，準(zhǔn)確終止）圖6-1基因表達(dá)的第一步是由RNA聚合酶拷貝DNA雙鏈中的模板鏈，生成與該序列完全互補(bǔ)的RNA鏈?；虮磉_(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下二方面：轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（transcriptionalregulation）；轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（post-transcriptionalregulation），包括（1）mRNA加工成熟水平調(diào)控（differentialprocessingofRNAtranscrpt）；（2）翻譯水平調(diào)控（differentialtranslationofmRNA）?；靖拍睿翰倏v子：指原核生物中由一個(gè)或多個(gè)相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控元件組成的基因表達(dá)單元。（如：乳糖操縱子，包括啟動(dòng)子操縱基因和結(jié)構(gòu)基因三部分，調(diào)控的最小單位）順式作用元件：調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子等，位于染色體上的一段DNA序列反式作用因子：可溶性蛋白，可作用于不同染色體上的順式作用元件，如阻遏蛋白等誘導(dǎo)物：也稱效應(yīng)物，指小分子物質(zhì)，誘導(dǎo)反應(yīng)進(jìn)行的物質(zhì)，如乳糖。誘導(dǎo)和阻遏：誘導(dǎo)即有利于反應(yīng)的順利進(jìn)行；阻遏即阻止反應(yīng)的進(jìn)行。正調(diào)控和負(fù)調(diào)控：正調(diào)控即促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行；負(fù)調(diào)控即不利于反應(yīng)的順利進(jìn)行組成型基因和誘導(dǎo)型基因

原核生物的基因調(diào)控主要是轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和正轉(zhuǎn)錄調(diào)控。負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控：調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白（repressor）阻遏蛋白作用于操縱區(qū)。負(fù)控誘導(dǎo)：阻遏蛋白不與誘導(dǎo)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄負(fù)控阻遏：阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。正轉(zhuǎn)錄調(diào)控：調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白（activator）正控誘導(dǎo)：誘導(dǎo)物的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)正控阻遏：誘導(dǎo)物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)OperoncontrolmodelnegativepositiveInd.Rep.activeactiveinactiveinactive6.2乳糖操縱子與負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)

大腸桿菌乳糖操縱子（lactoseoperon）包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：Z、Y和A，以及啟動(dòng)子、控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是在啟動(dòng)區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的。LacoperonIpoZYA3個(gè)結(jié)構(gòu)基因各決定一種酶：Z編碼-半乳糖苷酶；Y編碼-半乳糖苷透過酶；A編碼-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過酶的作用是使外界的β-半乳糖苷透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。6.2.1酶的誘導(dǎo)—lac體系受調(diào)控的證據(jù) 一般情況下，lac+基因型大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶和透過酶的濃度很低，每個(gè)細(xì)胞只有1～2個(gè)酶分子。但是，在乳糖培養(yǎng)基上酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的6%或7%，超過105個(gè)酶分子/細(xì)胞。

在無葡萄糖有乳糖的培養(yǎng)基中，lac+細(xì)菌中將同時(shí)合成β-半乳糖苷酶和透過酶。

用32P標(biāo)記的mRNA與模板DNA進(jìn)行定量分子雜交，表明培養(yǎng)基中加入乳糖1～2分鐘后，編碼β-半乳糖苷酶和透過酶的lacmRNA量就迅速增加，去掉乳糖后，lacmRNA量立即下降。

實(shí)驗(yàn)室常用兩種乳糖類似物—異丙基巰基半乳糖苷（IPTG）和巰甲基半乳糖苷（TMG），在酶活性分析中常用發(fā)色底物O-硝基半乳糖苷（ONPG）。因?yàn)樗鼈兌疾皇前肴樘擒彰傅牡孜铮杂址Q為安慰性誘導(dǎo)物（gratuitousinducer）。用35S標(biāo)記大腸桿菌細(xì)胞（培養(yǎng)基中沒有半乳糖），將這些帶有放射性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含35S的培養(yǎng)基中，加入誘導(dǎo)物后β-半乳糖苷酶便開始合成。分離純化β-半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無35S標(biāo)記，說明這種酶是加入誘導(dǎo)物后新合成的。6.2.2操縱子模型及其影響因子

Jacob和Monod認(rèn)為誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時(shí)稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個(gè)基因調(diào)控問題，而且可以用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究，他們通過大量實(shí)驗(yàn)及分析，建立了現(xiàn)在已經(jīng)被人們廣泛接受的乳糖操縱子的控制模型。圖6-9Lac操縱子的調(diào)控模式。A.Z、Y、A基因產(chǎn)物由同一條多順反子mRNA分子所編碼。B.該mRNA分子的啟動(dòng)區(qū)（P）位于阻遏基因（I） 與操縱區(qū)（O）之間，不能單獨(dú)起始半乳糖苷酶 和透過酶基因的高效表達(dá)。C.操縱區(qū)是DNA上的一小段序列（僅為26bp），是阻遏物的結(jié)合位點(diǎn)。D.當(dāng)阻遏物與操縱區(qū)相結(jié)合時(shí)，lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。E.誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變其三維構(gòu)象，使 之不能與操縱區(qū)相結(jié)合，誘發(fā)lacmRNA的合成。阻遏物lacI基因產(chǎn)物及功能lac操縱子阻遏物mRNA是由弱啟動(dòng)子控制下永久型合成的，該阻遏蛋白有4個(gè)相同的亞基，每個(gè)亞基均含有347個(gè)氨基酸殘基，并能與1分子IPTG結(jié)合,每個(gè)細(xì)胞中有5～10個(gè)阻遏物分子。

β-半乳糖苷酶在乳糖代謝中的作用是把前者分解成葡萄糖及半乳糖。如果將葡萄糖和乳糖同時(shí)加入培養(yǎng)基中，大腸桿菌在耗盡外源葡萄糖之前不會(huì)誘發(fā)lac操縱子（圖6-11）。6.2.3lac操縱子的調(diào)控區(qū)域—P、O區(qū)

P區(qū)（即啟動(dòng)子區(qū)）一般是從I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游5-10bp，而O區(qū)（即阻遏物結(jié)合區(qū)）位于-7～+28位，該區(qū)的堿基序列有對(duì)稱性，其對(duì)稱軸在+11位堿基對(duì)。圖6-16不同操縱子啟動(dòng)區(qū)及O區(qū)相對(duì)位置的比較。6.2.4lac操縱子中的其他問題

1、lac基因產(chǎn)物數(shù)量上的比較

在完全被誘導(dǎo)的細(xì)胞中，β-半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉(zhuǎn)移酶的拷貝數(shù)比例為1：0.5：0.2，這個(gè)比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作為唯一碳源時(shí)細(xì)胞的需要。不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)節(jié)所致。①lacmRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。因此，存在著從mRNA的5'末端到3'末端的蛋白質(zhì)合成梯度。②在lacmRNA分子內(nèi)部，A基因比Z基因更易受內(nèi)切酶作用發(fā)生降解，因此，在任何時(shí)候Z基因的完整拷貝數(shù)要比A基因多。2、操縱子的融合與基因工程

pur操縱子在染色體上位于lac操縱子沿轉(zhuǎn)錄方向的下游，中間只隔了一個(gè)控制細(xì)胞對(duì)T6噬菌體敏感性的tsx基因。pur操縱子被“嫁接”到lac啟動(dòng)子上，形成融合基因。因?yàn)閘ac啟動(dòng)子是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子，通過它可以使較弱啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。6.3色氨酸操縱子與負(fù)控阻遏系統(tǒng)trp體系參與生物合成，它不受葡萄糖或cAMP-CRP的調(diào)控。色氨酸的合成主要分5步完成，有7個(gè)基因參與整個(gè)合成過程（圖6-17）。圖6-17細(xì)菌中色氨酸生物合成途徑。6.3.1trp操縱子的阻遏系統(tǒng)trpR基因突變常引起trpmRNA的永久型合成，該基因產(chǎn)物因此被稱為輔阻遏蛋白（aporepressor）。除非培養(yǎng)基中有色氨酸，否則這個(gè)輔阻遏蛋白不會(huì)與操縱區(qū)結(jié)合。輔阻遏蛋白與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物，與操縱區(qū)結(jié)合并關(guān)閉trpmRNA轉(zhuǎn)錄。

效應(yīng)物分子色氨酸是trp操縱子所編碼的生物合成途徑的末端終產(chǎn)物。 當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸含量較高時(shí)，它與游離的輔阻遏蛋白相結(jié)合，并使之與操縱區(qū)DNA緊密結(jié)合；當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸供應(yīng)不足時(shí)，輔阻遏物失去色氨酸并從操縱區(qū)上解離，trp操縱子去阻遏。6.3.2弱化子與前導(dǎo)肽1、弱化子

在trpmRNA5’端有一個(gè)長162bp的mRNA片段被稱為前導(dǎo)區(qū)，其中123～150位堿基序列如果缺失，trp基因表達(dá)可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉(zhuǎn)錄總是在這個(gè)區(qū)域終止，產(chǎn)生一個(gè)僅有140個(gè)核苷酸的RNA分子，終止trp基因轉(zhuǎn)錄。這個(gè)區(qū)域被稱為弱化子，該區(qū)mRNA可通過自我配對(duì)形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。2、前導(dǎo)肽分析前導(dǎo)序列發(fā)現(xiàn)，它包括起始密碼子AUG和終止密碼子UGA，能產(chǎn)生一個(gè)含有14個(gè)氨基酸的多肽，這個(gè)假設(shè)的多肽被稱為前導(dǎo)肽。在前導(dǎo)序列的第10和第11位上有相鄰的兩個(gè)色氨酸密碼子。組氨酸操縱子含有7個(gè)相鄰的組氨酸密碼子，苯丙氨酸操縱子也有7個(gè)苯丙氨酸密碼子，這些密碼子參與了操縱子中的轉(zhuǎn)錄弱化機(jī)制。3、mRNA前導(dǎo)區(qū)的序列分析

trp前導(dǎo)區(qū)的堿基序列已經(jīng)全部測定，引人注目的是其中4個(gè)分別以1、2、3和4表示的片段能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對(duì)，有時(shí)以1-2和3-4配對(duì)，有時(shí)只以2-3方式互補(bǔ)配對(duì)。

RNaseT1降解實(shí)驗(yàn)（此酶不能水解配對(duì)的RNA）表明，純化的trp前導(dǎo)序列中確有1-2和3-4的配對(duì)方式，由此定位的3-4配對(duì)區(qū)正好位于終止密碼子的識(shí)別區(qū)，當(dāng)這個(gè)區(qū)域發(fā)生破壞自我配對(duì)的堿基突變時(shí)有利于轉(zhuǎn)錄的繼續(xù)進(jìn)行（圖6-23）。4、轉(zhuǎn)錄弱化作用

培養(yǎng)基中色氨酸濃度低，負(fù)載有色氨酸的tRNATrp就少，翻譯通過兩個(gè)相鄰色氨酸密碼子的速度就慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時(shí)，核糖體才進(jìn)行到1區(qū)（或停留在兩個(gè)相鄰的trp密碼子處），前導(dǎo)區(qū)2-3配對(duì)，不形成3-4配對(duì)的終止結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行。

培養(yǎng)基中色氨酸濃度高，核糖體順利通過兩個(gè)相鄰的色氨酸密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前就到達(dá)2區(qū)，3-4區(qū)自由配對(duì)形成莖-環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止。所以，弱化子對(duì)RNA聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。圖6-24trp操縱子前導(dǎo)序列的變構(gòu)與轉(zhuǎn)錄的弱化。

一般認(rèn)為，阻遏物從有活性向無活性的轉(zhuǎn)變速度較慢，需要有一個(gè)能更快地做出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)纳彼崴?。弱化子能較快地通過抗終止的方法來增加trp基因表達(dá)，迅速提高內(nèi)源色氨酸濃度。那么，為什么還要有阻遏體系呢？阻遏物的作用是在有大量外源色氨酸存在