第05章 分子發(fā)光

第五章分子發(fā)光

—熒光、磷光和化學(xué)發(fā)光法分析化學(xué)（儀器分析部分）

分子發(fā)光

MolecularLuminescence分子熒光分子磷光化學(xué)發(fā)光生物發(fā)光散射光譜

光致發(fā)光：分子吸收了光能而被激發(fā)至較高能態(tài)，在返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出與吸收光波長(zhǎng)相等或不等的輻射，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光：化學(xué)反應(yīng)中，產(chǎn)物分子吸收了反應(yīng)過程中釋放的化學(xué)能而被激發(fā)，在返回基態(tài)時(shí)發(fā)出光輻射。目錄5-1熒光和磷光光譜法 5-1-1基本原理 5-1-2熒光分析儀器 5-1-3熒光分析方法的特點(diǎn)與應(yīng)用 5-1-4磷光分析法5-2化學(xué)發(fā)光與生物發(fā)光分析法 5-2-1基本原理 5-2-2發(fā)光反應(yīng)的類型與應(yīng)用熒光（fluorescence）現(xiàn)象的第一次記錄：1575年，西班牙內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes，觀察到LignumNephriticum木頭切片的水溶液呈現(xiàn)天藍(lán)色。第一次被提議用于分析：1864年，Stokes第一次用于分析：1867年，Goppelsr?der根據(jù)Al-桑色素配合物的熒光，建立了Al3+的熒光測(cè)定方法。GeorgeGabrielStokes(1819-1903)參考文獻(xiàn)：

陳國珍，黃賢智，鄭本梓，許金鉤，王尊

本，熒光分析法，科學(xué)出版社，北京，1990JosephR.Lakowicz,PrincipleofFluorescenceSpectroscopy,KluwerAcademic/PlenumPublishers,NewYork,1999netLibrary電子圖書基態(tài)單重態(tài)S激發(fā)態(tài)單重態(tài)S激發(fā)態(tài)三重態(tài)T 10-8s10-4-1s

5-1-1基本原理

5-1-1-1熒光和磷光的產(chǎn)生1．單重態(tài)和三重態(tài)

基態(tài)單重態(tài)(singletstate)：自旋電子成對(duì),只有一種自旋方向↑↓,電子自旋總和是零，光譜項(xiàng)的多重性是1，以S0表示;當(dāng)基態(tài)電子激發(fā)到某高能級(jí)時(shí),將有兩種激發(fā)態(tài)：即受激電子自旋相反與自旋平行:↑↓h、↑↑h。自旋平行多重性為M=2x1+1=3，稱為激受三重態(tài)（tripletstate）用T表示，自旋相反多重性為1，稱為激受單重態(tài)，用S表示；

激發(fā)單重態(tài)S與激發(fā)三重態(tài)T的不同點(diǎn)：⑷激發(fā)三重態(tài)的能量較激發(fā)單重態(tài)的能量低。⑶基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)為允許躍遷，基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)為禁阻躍遷；⑵tS=10-8s,tT=10-4～1s；⑴S是抗磁分子，T是順磁分子；2．分子內(nèi)的光物理過程輻射躍遷：熒光：S1最低振動(dòng)能級(jí)—S0磷光：S——T非輻射躍遷：振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間竄躍非輻射能量傳遞過程

振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重度電子能級(jí)中,等能級(jí)間的無輻射能級(jí)交換。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間竄躍：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。輻射能量傳遞過程

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)，多為S1→S0躍遷，發(fā)射波長(zhǎng)為

‘2的熒光；10-7～10-9s。

由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)；

‘2>

2>

1；

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)，T1→S0躍遷；電子由S0進(jìn)入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～100s。光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。5-1-1-2光譜曲線激發(fā)exmax 發(fā)射emmax 磷光（phosphorescence）特征：（1）Stokes位移（2）ex一般不影響emsp的形狀（3）吸收光譜與emsp的鏡像關(guān)系激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如

‘2)。c.鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似；基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

5-1-1-3熒光的影響因素1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 量子產(chǎn)率:

熒光物質(zhì)發(fā)射光子數(shù)與吸收激發(fā)光子數(shù)之比（當(dāng)非輻射躍遷A返回基態(tài)的概率很小時(shí)，

F接近于1，在通常情況下，

F總是小于1的）2．熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。3．熒光與金屬螯合物(1)配體發(fā)光

熒光弱 熒光強(qiáng)(2)金屬發(fā)光

Mn(II) d* d4．溶劑效應(yīng)

同一種熒光物質(zhì)溶于不同溶劑，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度可能有明顯不同。一般情況下，隨著溶劑的極性的增加，熒光物質(zhì)的π→π*躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)也發(fā)生紅移。5．溫度的影響

一般說來，大多數(shù)熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度的降低，熒光效率和熒光強(qiáng)度將增加，相反，溫度升高熒光效率將下降。如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，熒光效率增加3%，冷至-80℃時(shí)，熒光效率為100%。碰撞能量轉(zhuǎn)移O2的作用(光漂白)自熄滅、自吸收

(內(nèi)濾效應(yīng))6．熒光熄滅（猝滅）

Fluorescencespectra(

-)ofTPPandabsorptionspectra(---)ofETH5294inplasticizedPVCmembrane:a.ExcitationspectrumofTPP;b.EmissionspectrumofTPP;c.UnprotonatedETH5294;d.ProtonatedETH5294.

熒光物質(zhì)分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子相互作用，引起熒光強(qiáng)度降低、消失或熒光強(qiáng)度與濃度不呈現(xiàn)線性關(guān)系的現(xiàn)象。5-1-1-4熒光強(qiáng)度的定量關(guān)系

k與儀器有關(guān)的常數(shù)I0激發(fā)光的強(qiáng)度

F熒光量子產(chǎn)率

熒光物質(zhì)在激發(fā)波長(zhǎng)處的摩爾吸光系數(shù)l光程長(zhǎng)度。

根據(jù)Parker方程，熒光強(qiáng)度F與熒光物質(zhì)的濃度c之間的關(guān)系是：

當(dāng)

cl項(xiàng)很小時(shí)，括號(hào)內(nèi)第二項(xiàng)及以后的高次項(xiàng)均可忽略不計(jì)，Parker方程可簡(jiǎn)化為：

19世紀(jì)前

肉眼觀察

1928年Jette，West發(fā)明光電比色計(jì)

1939年

應(yīng)用光電倍增管（PMT）

1952年

商品化校正光譜儀器

1980年后

計(jì)算機(jī)化

5-1-2熒光分析儀器5-1-2-1熒光分析儀器框圖光源激發(fā)單色器樣品池發(fā)射單色器檢測(cè)器信號(hào)處理顯示I0FI15-1-2-2熒光分光光度計(jì)部件理想的熒光分析儀器?1．光源：鎢燈、汞燈、氙燈、激光激發(fā)光源應(yīng)具有穩(wěn)定性好、強(qiáng)度大、適用波長(zhǎng)范圍寬等特點(diǎn)。其中穩(wěn)定性：影響測(cè)定的重現(xiàn)性和精密度；強(qiáng)度：影響測(cè)定的靈敏度。2．單色器：濾光片、光柵激發(fā)單色器和發(fā)射單色器3．檢測(cè)器 PMTPhotomultiplier CCDChargeCoupledDevice CIDChargeInjectedDevice

4．信號(hào)處理HITACHIFluorescenceSpectrophotometerF-4500FeaturesThreedimensionalcontourplotsPhosphorescence

Inadditiontofluorescenceandphosphorescencemeasurementsluminescenceisincludedasstandard.Theintense150wattxenonsourceprovidesmaximumlightenergyovertheentire200-900nmwavelengthrangeofthespectrophotometer.Ouruniquehorizontalbeamgeometryoftheexcitationandemissionbeamsincreasessensitivityandrequiresonly0.6mLofsampleinastandard10mmcuvette.靈敏度高：比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)； 檢測(cè)下限：0.1～0.1ug/cm-3 相對(duì)靈敏度：0.05-0.005ppb（0.05MH2SO4)選擇性高重現(xiàn)性好取樣量少儀器不復(fù)雜5-1-3熒光分析方法的特點(diǎn)及應(yīng)用 1．特點(diǎn)

2．應(yīng)用

檢測(cè)：金屬離子、有機(jī)物、生物分子生物分子相互作用研究疾病診斷（參見附件）

定性分析：依據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)所發(fā)射的熒光波長(zhǎng)不同；定量分析：同種物質(zhì)的稀溶液，其產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系。5-1-4磷光分析法 1．如何獲得較強(qiáng)的磷光增加試樣的剛性: 低溫冷凍固體磷光法： 吸附于固相載體（濾紙）分子締合物的形成： 加入表面活性劑等重原子效應(yīng)： 加入含重原子的物質(zhì)，如銀鹽等敏化磷光： 通過能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生磷光 磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí) →基態(tài)，T1→S0躍遷；電子由S0進(jìn)入T1的可能過程：（S0→T1禁阻躍遷）2．磷光分析儀器

熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光。液槽斬波片

測(cè)量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源和可控檢測(cè)及時(shí)間分辨技術(shù)。室溫測(cè)量時(shí)，不需要杜瓦瓶。3.應(yīng)用稠環(huán)芳烴和石油產(chǎn)物 采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測(cè)定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；見表農(nóng)藥、生物堿、生長(zhǎng)激素 煙堿、降煙堿、新煙堿，2，4-D等分析 檢測(cè)限0.01ug/cm-3

藥物分析 見表5-2化學(xué)與生物發(fā)光分析法

5-2-1基本原理1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)（Chemiluminescence）在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光。A+B→C+D*D*→D+h

（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；（2）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)

E=170～300kJ/mol；位于可見光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行；

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)如果存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光（bioluminescence）。2.化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：時(shí)刻t的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt分析物參加反應(yīng)的速率；3.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)在化學(xué)發(fā)光分析中，被分析物相對(duì)于發(fā)光試劑少得多，對(duì)于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：dc/dt=Kc；K為反應(yīng)速率常數(shù)。定性依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強(qiáng)度與被測(cè)物濃度成線性；（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強(qiáng)度(S)，其與被測(cè)物濃度成線性：4.裝置與技術(shù)裝置流程：發(fā)光反應(yīng)室光檢測(cè)器信號(hào)放大器顯示與記錄

發(fā)光反應(yīng)可采用靜態(tài)或流動(dòng)注射的方式進(jìn)行：

靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應(yīng)器中混合，測(cè)最大光強(qiáng)度或總發(fā)光量；試樣量小，重復(fù)性差；

流動(dòng)注射方式：用蠕動(dòng)泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時(shí)通過測(cè)量室，連續(xù)發(fā)光，測(cè)定光強(qiáng)度；試樣量大；5.特點(diǎn)

靈敏度極高例：熒光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化學(xué)發(fā)光分析，可測(cè)定210-17mol/L的ATP，即可檢測(cè)出一個(gè)細(xì)菌中的ATP含量?jī)x器設(shè)備簡(jiǎn)單

不需要光源、單色器和背景校正；發(fā)射光強(qiáng)度測(cè)量無干擾

無背景光、散射光等干擾；線性范圍寬分析速度快缺點(diǎn)：可供發(fā)光用的試劑少；發(fā)光反應(yīng)效率低（大大低于生物體中的發(fā)光）；機(jī)理研究少。

5-2-2發(fā)光反應(yīng)的類型與應(yīng)用1.氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)用于大氣中O3、NO、NO2、H2S、SO2、CO等組分的監(jiān)測(cè)。a.一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)

NO+O3→NO2*NO2*→