第七章 制作課件 抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用

第七章抗原抗體反

應(yīng)及應(yīng)用

基本內(nèi)容第一節(jié)抗體的制備和應(yīng)用第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用第一節(jié)抗體的制備抗血清的制備單克隆抗體的制備基因工程抗體的制備抗體的制備抗體種類：第一代抗體

多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體

單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體

基因工程抗體（geneticengineeringantibody)技術(shù)路線免疫動物抗血清的純化與保存抗血清的特性鑒定（效價、親和力、特異性）（飽和硫酸胺鹽法和層析法）一、抗血清的制備二、單克隆抗體的制備單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）

由單一克隆B細胞雜交瘤產(chǎn)生的，只識別抗原分子某一特定抗原決定簇的特異性抗體。特點：具有高度均一性。雜交瘤細胞：骨髓瘤細胞———無限增殖；免疫B細胞———合成、分泌特異性抗體。

細胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強免疫（一）免疫小鼠

動物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重（二）骨髓瘤細胞篩選標準：1.瘤細胞本身不產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生抗體的某種鏈，但不能分泌。2.是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型。（三）細胞融合細胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑作用機理：誘導(dǎo)細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑

T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA骨髓瘤細胞:

HGPRT-，TK-;死亡脾細胞:

HGPRT+，TK+;短命(3天)雜交瘤細胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細胞、脾細胞與雜交瘤細胞雜交瘤細胞：長期生長繁殖利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力飼養(yǎng)細胞：細胞密度過低不利于細胞生長繁殖常用小鼠腹腔細胞作飼養(yǎng)細胞其中MQ還有清除死亡細胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細胞的純化。飼養(yǎng)細胞特點：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含1個細胞有限稀釋法（四）陽性雜交瘤細胞的篩選及克隆化單克隆抗體的擴大生產(chǎn)腹水制備大瓶培養(yǎng)中空纖維反應(yīng)器優(yōu)點：在體外“永久”地存活并傳代用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標記抗體為特點的免疫學(xué)分析方法可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療單克隆抗體的優(yōu)點與局限性局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍反應(yīng)強度不如多克隆抗體制備技術(shù)復(fù)雜、費時費工、價格較高

McAbPcAb

抗原要求可以不純純度高特異性高低穩(wěn)定低高成本高低McAb與PcAb的比較五、單克隆抗體的應(yīng)用1、作為醫(yī)學(xué)檢驗試劑2、作為親合層析的配體3、作為生物治療的導(dǎo)向武器三、基因工程抗體的制備基因工程抗體（geneticengineeringantibody）在DNA水平對Ig基因進行切割、拼接或修飾，導(dǎo)入受體細胞表達的抗體。如：人-鼠嵌合抗體（chimericantibody）改型抗體（reshapedhumanizedantibody）小分子抗體：Fab片段Fc片段Fv片段雙特異性抗體（bispecificantibody），如：Ig-融合蛋白，抗體導(dǎo)向酶等。嵌合抗體第二節(jié)抗原抗體反應(yīng)及其應(yīng)用

最早建立的免疫學(xué)檢測技術(shù)是根據(jù)Ag，Ab特異性結(jié)合原理用已知Ag檢測血清中未知Ab，故稱為血清學(xué)反應(yīng)。隨著免疫學(xué)理論的進展及相關(guān)學(xué)科新技術(shù)在免疫學(xué)的應(yīng)用，近年來建立了不少免疫學(xué)新技術(shù)。這些新技術(shù)不僅推動了免疫學(xué)的發(fā)展也是輔助疾病的診斷，療效評估和探討疾病機制的重要手段。一、抗原抗體反應(yīng)特點影響因素

（一）抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點:

1.高度特異性：2.可逆性:抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡,其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab抗體的親和力：抗原抗體間的固有結(jié)合力，可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]3.適當濃度和比例:

Ab過剩4.敏感性:在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴散法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿。（二）影響抗原抗體反應(yīng)的因素:

1.電解質(zhì)

：抗原抗體特異結(jié)合后，膠體粒便可發(fā)生脫水作用，此時易受電解質(zhì)影響，如有適當濃度的電解質(zhì)存在就會使它們失去部分負電荷而相互凝聚，于是出現(xiàn)明顯的凝集或沉淀現(xiàn)象。2.酸堿度:合適的pH為6-8。3.溫度:37度通常是抗原體反應(yīng)最適溫度。二、抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用根據(jù)抗原的性質(zhì)、結(jié)合反應(yīng)的現(xiàn)象、參與反應(yīng)的成分等因素，可將抗原抗體反應(yīng)分為：凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補體參與的反應(yīng)中和反應(yīng)采用標記物的抗原抗體反應(yīng)等

（一）凝集反應(yīng)（agglutination）顆粒性抗原（紅細胞、細菌、乳膠顆粒等）與抗體特異性結(jié)合，形成肉眼可見的凝集塊。1、直接凝集(directagglutination)

玻片凝集、試管凝集2、間接凝集（indirectagglutination）

可溶性抗原或抗體包被在乳膠顆粒或紅細胞表面，與相應(yīng)抗體或抗原混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。正向間接凝集試驗反向間接凝集試驗