利用多孔微載體大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的研究

利用多孔微載體大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的研究

動物的細胞培養(yǎng)始于本世紀初。1962年,其規(guī)模開始擴大,發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學研究和應用中廣泛采用的技術方法,利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等,已成為醫(yī)藥生物高技術產(chǎn)業(yè)的重要部分。利用動物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術產(chǎn)品市場份額的50%。大量資料表明,生物技術藥物是當前新藥開發(fā)的重要領域,生物技術制藥工業(yè)是下一個10年制藥工業(yè)的重要新門類,期間將有數(shù)百種生物技術新藥上市。美國最新預測幾種暢銷基因工程藥物2000年全球銷售額EPO大于30億美元,G-CSF大于20億美元,HGH、IFN、UK均大于10億美元,胰島素和降鈣素大于5億美元。動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術是生物技術制藥中非常重要的環(huán)節(jié)。目前,動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術水平的提高主要集中在培養(yǎng)規(guī)模的進一步擴大、優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率與保證其質(zhì)量上。1細胞生長的維持在大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的過程中,最根本的是使細胞的培養(yǎng)條件達到最優(yōu)化,盡可能消除或減輕環(huán)境對細胞的影響,維持細胞高存活力和高效表達,同時又要充分考慮細胞表達產(chǎn)物的后續(xù)純化。1.1無血清培養(yǎng)基動物細胞培養(yǎng)基是細胞賴以體外生長、增殖、分化的重要因素。目前,大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中已經(jīng)普遍使用無血清培養(yǎng)基,在此之前使用過天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基避免了血清培養(yǎng)基污染的可能性,并減少了純化的難度。但無血清培養(yǎng)基沒有廣泛的適應性,不同的細胞甚至不同的細胞株和細胞系有各自獨立的無血型培養(yǎng)基配方。如在DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基中添加了Se、乙醇胺、多種維生素、蛋白胨、胰島素、轉鐵蛋白和一些細胞因子,構成了SFM-p。SFM-p不含牛血清白蛋白而能維持細胞生長和rHuEPO的生產(chǎn)。但采用無血清培養(yǎng)而誘發(fā)的細胞凋亡也成為動物細胞無血清培養(yǎng)技術中急待解決的問題。在培養(yǎng)基中加入某些化合物,如金精三羧酸(ATA)、鋅離子、抗氧化劑和細胞因子等,在一定程度上可阻止因采用無血清培養(yǎng)基而導致的細胞凋亡。1.2生物反應器的發(fā)展動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)需要特殊的生物反應器。與微生物和植物細胞不同,動物細胞的外層是質(zhì)膜,脆性大,在反應器中務必減少剪切力。自70年代以來,用于動物細胞培養(yǎng)的生物反應器有很大的發(fā)展,種類越來越多,規(guī)模越來越大。根據(jù)生物反應器的用途不同,有懸浮培養(yǎng)用、貼壁培養(yǎng)用和包埋培養(yǎng)用生物反應器等。1.2.1外循環(huán)式生物反應器氣升式生物反應器的基本原理是氣體混合物從底部的噴射管進入反應器的中央導流管,使得中央導流管側的液體密度低于外部區(qū)域從而形成循環(huán)。氣升式生物反應器主要采用內(nèi)循環(huán),但也有采用外循環(huán)式。1979年Katinger等首次應用氣生式生物反應器進行動物細胞懸浮培養(yǎng)。英國Celltech公司是應用氣生式生物反應器進行動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的成功范例,1985年應用100L規(guī)模的氣生式生物反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細胞。該公司已經(jīng)開發(fā)出了10000L規(guī)模的氣生式生物反應器用于各類單抗的大量生產(chǎn)。國內(nèi)已經(jīng)有人設計制造了10L規(guī)模的氣生式生物反應器用于培養(yǎng)哺乳動物細胞、昆蟲細胞等各類生物制品。1.2.2毛細管生長表面積其原理為泵動培養(yǎng)液通過成束的合成空心纖維管(毛細管)而使細胞固著在毛細管內(nèi)壁生長。如果毛細管的直徑為350μm,表面積/體積比率為30.7,大量成束的毛細管內(nèi)壁提供了大量的生長表面積。它的用途較廣,既可培養(yǎng)懸浮生長的細胞,又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞,細胞密度最高可達109mL-1。主要用于雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。1.2.3材料好的反應器,細胞分離流化床生物反應器的基本原理是培養(yǎng)液通過反應器垂直向上循環(huán)流動,不斷提供給細胞必要的營養(yǎng)成分,使細胞得以在微粒中生長;同時,不斷加入新鮮培養(yǎng)液。這種反應器的傳質(zhì)性能好,并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器,能快速提供給高密度細胞所需要的氧,同時排出代謝產(chǎn)物;反應器中的液體流速足以使細胞微粒懸浮卻不損壞脆弱的細胞。流化床生物反應器滿足了高密度細胞培養(yǎng),使高產(chǎn)量細胞長時間停留在反應器中,優(yōu)化了細胞生長與產(chǎn)物合成的環(huán)境等細胞培養(yǎng)的要求?？捎糜谫N壁依賴性細胞和非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。1.2.4個數(shù)字控制裝置dcuB.BraunMD10攪拌罐生物反應器,內(nèi)裝一個100μm孔徑的旋轉濾器,工作體積為8L。一個數(shù)字控制裝置(DCU)用于控制溫度、pH值、攪拌速度和溶氧(DO)。底部的環(huán)形噴氣結構起通氣作用。新鮮培養(yǎng)基分散進入旋轉濾器的外部區(qū)域,從旋轉濾器的中間獲得無微載體的收集液。旋轉濾器一般由不銹鋼絲網(wǎng)構成,有良好的生物相溶性,易于清洗和消毒,可重復和長期使用。這種裝置已經(jīng)大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多種細胞。1.2.5減少固化床內(nèi)的線性流速,縮短外部通氣裝置的通氣管長度在流化床玻璃柱的底部加一個有0.5mm小孔的鋼網(wǎng)。但培養(yǎng)基循環(huán)的方向相反,微載體堆積于鋼網(wǎng)上沒有移動。固化床內(nèi)的線性流速減低至14cm/min(流化床內(nèi)的線性流速75cm/min),氣體通過硅膠膜擴散。把外部通氣裝置的通氣管長度從10m縮短至2m,可以減少工作體積大于70~100mL。開孔玻璃載體(硼酸硅玻璃)直徑400~700μm,孔徑60~120μm,孔積率50%,可供細胞附著。1.2.6堆積床contestCelligenPlus堆積床生物反應器的工作原理為:當推進器(impeller)旋轉時,培養(yǎng)基通過推進器的中心空管螺旋式地從罐體底部往上流,然后從3個出口中流出,通過堆積床向下流動至罐體底部,再通過推進器的中心管往上流。細胞附著在堆積床的聚酯片上,氣體從噴射器噴出進入培養(yǎng)基中。通過調(diào)節(jié)氣體混合物的組成成分,完成對pH和DO的控制,加入氧氣或氮氣以滿足培養(yǎng)過程中氧氣的吸收;當pH太高時加入CO2;空氣作為一種填充氣體,保持氣體進入罐體時流速的穩(wěn)定。培養(yǎng)基通過蠕動泵從培養(yǎng)基儲存瓶(mediareservoir)中進入反應器,收集液通過蠕動泵從反應器中流出進入收集瓶。堆積床有以下特點:貼壁依賴性和懸浮細胞可成功地在堆積床內(nèi)附著;細胞不接觸氣液界面,低漩流和低剪切力,細胞受到的傷害很小;反應器能以分批式或連續(xù)/灌流方式運轉,并可維持長時間;聚酯片提供高的表面積/體積比率,維持高細胞密度。1.2.7生物反應器生物處理和微生物消毒這種生物反應器由預先消毒的、FDA認可的、對生物無害的聚乙烯塑料箱組成,箱中部分填充培養(yǎng)基并接種細胞。箱中其余部分是空氣,培養(yǎng)過程中空氣連續(xù)通過這里,空氣通過完整的過濾器進入箱體。前后搖動箱體使液氣界面產(chǎn)生波動,大大提高了氧氣的溶解量,有利于排出CO2控制pH值,也促使培養(yǎng)液混合均勻,細胞和顆粒不會下沉。廢氣通過一個消毒過濾器和逆止閥。整個生物反應器置于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)用CO2培養(yǎng)箱中,便于控制溫度和pH值,或者在箱體底部加熱控制溫度。培養(yǎng)細胞的密度可達到7×106mL-1和100L的工作體積。使用前箱體用γ射線消毒,用后丟棄。特殊的開孔可進行無菌加樣、取樣,而不必把生物反應器置于層流罩中。裝置簡單,易于操作,成本低,低剪切力,無空氣鼓泡減低了氣泡對細胞的損害?？捎糜谂囵B(yǎng)動物細胞和植物細胞,并十分適合生產(chǎn)病毒。已經(jīng)此反應器成功懸浮培養(yǎng)重組NS0細胞生產(chǎn)單克隆抗體;懸浮培養(yǎng)人293細胞生產(chǎn)腺病毒(adenovirus);用昆蟲sf9細胞生產(chǎn)棒狀病毒(baculovirus);用微載體Cytodex3培養(yǎng)人393細胞。1.3微載體的使用許多被培養(yǎng)的動物細胞都是貼壁依賴性細胞,所以大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中都使用微載體。理想的微載體應有利于細胞的快速附著和擴展,有利于細胞高密度生長,不干涉代謝產(chǎn)物的合成和分泌,允許細胞易于脫落。自1967年以來,微載體已成功應用于培養(yǎng)原代細胞和建立細胞系,如CHO細胞和VERO細胞,以生產(chǎn)重組蛋白。而且自使用微載體后已經(jīng)取得了許多技術上的進步。微載體的大小和電荷量達到了最優(yōu)化,以提高細胞的生長能力;表層材料如骨膠原/明膠、玻璃、聚賴氨酸用于微載體的表面;微載體的基質(zhì)材料更多,如DEAE-葡聚糖、骨膠原/明膠、玻璃、聚丙乙烯、聚丙烯酰胺、纖維素。球形微載體因制造容易而普遍使用,近年來開始使用的多孔微載體可提供大的表面積/體積比率和最大的細胞密度。細胞成功地在微載體上擴展的能力隨細胞系和培養(yǎng)基不同而變化,為特定細胞選擇合適的微載體比選擇微載體本身更重要。選擇微載體對細胞附著、細胞的進一步擴展和重組蛋白的表達有更大的影響。以下為部分微載體的介紹(見表1)。Cytodex和Cytopore微載體都適合高密度細胞培養(yǎng)。因為Cytopore微載體有更大的表面積,漂浮的細胞比率低,細胞生長速度更快,所以比Cytodex微載體更適合高密度細胞培養(yǎng)。Cytodex1和Cytodex3有更快的細胞轉移速度,細胞的球轉球過程在微載體之間完成,而不是通過漂浮的細胞。因大多數(shù)細胞生活在多孔的Cytopore微載體內(nèi),表面的細胞較少,降低了細胞的轉移速度,所以Cytodex和Cytopore微載體有不同的細胞轉移速度。多孔微載體的研制替代了容易使細胞受機械攪拌與噴氣損傷的常規(guī)載體。對于有些細胞株盡可能貼在微載體內(nèi),但“移動性”很差,因此需要發(fā)明一種更好的培養(yǎng)方式,提高微孔的開放性或者改善其表面特性,從而提高細胞貼壁率同時增加細胞移動性。軍事醫(yī)學科(學院在化工冶金研究所的協(xié)助下用聚苯乙烯試制了SH-2型微載體,可以耐受110℃高壓蒸汽滅菌,在121℃下使用也僅部分結團。使用后經(jīng)胰酶消化、硫化處理后可以反復使用。采用SH-2型微載體和新研制的低血清培養(yǎng)基添加劑BIGBEGF-2,在改進了的灌流系統(tǒng)控制下灌流培養(yǎng)產(chǎn)尿激酶原CHO工程細胞CL-11G,所得細胞密度超過1×107mL-1,尿激酶原平均活性為4007IU/mL,最高達6614IU/mL,均高于以前采用5%血清培養(yǎng)基和Biosilon微載體培養(yǎng)時的水平。此外,還用CT-3型微載體(由華東理工大學研制)成功培養(yǎng)了Vero細胞。1.4ph值、溶解氧濃度的在線分析和控制大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中,生物離線取樣特別是產(chǎn)物濃度測定需要較長的時間,不能及時反應細胞生存環(huán)境中的各種參數(shù)變化。在線過程監(jiān)控顯得非常重要,可以創(chuàng)造適合細胞生存的最佳環(huán)境,減少污染?，F(xiàn)已經(jīng)能對溫度、pH值、溶解氧濃度進行在線分析,并可進行有效控制。最近幾年中有關細胞培養(yǎng)過程監(jiān)控的研究迅速增多。測量在線氧吸收速率確定從細胞生長期生產(chǎn)病毒到感染期和細胞死亡后終止感染的轉換時間;用在線葡萄糖分析儀的測定調(diào)整灌流速度;估測目前和未來生物反應過程中葡萄糖的吸收率及乳糖的生成率的軟件已經(jīng)研制成功。1.5glr檢測能力影響細胞培養(yǎng)的主要因素有:CO2、溶氧(DO)、溫度、pH值、葡萄糖、氨、乳酸、甲基乙二醛(MG)、培養(yǎng)基成分等。一般來說,最適CO2水平為4%~10%,溶氧維持在20%~50%,溫度大多數(shù)在37℃,pH值在7.0~7.4之間。葡萄糖是細胞培養(yǎng)過程中主要的能量來源,必須維持在一定水平。氨、乳酸、甲基乙二醛(MG)等是動物細胞培養(yǎng)的主要限制因素。氨離子抑制Glr代謝途徑,應限制Gln用量,并盡可能去除培養(yǎng)基中的氨;高濃度乳酸抑制細胞生長,應降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以減少乳酸產(chǎn)生,在大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中常常添加果糖,以減少葡萄糖的使用量;甲基乙二醛(MG)能改變氨基酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基和巰基,也主要通過降低葡萄糖用量來降低MG濃度。2參與細胞凋亡調(diào)控基因的表達在大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的初期,細胞數(shù)量不斷增加,表達重組蛋白的能力也在逐步提高。細胞表達隨細胞數(shù)量達到頂峰之后,細胞數(shù)量和表達水平將下降。因為用于生產(chǎn)具有重要醫(yī)用作用的生物活性蛋白的工程細胞,其基因組普遍整合了病毒載體,這就從根本上決定了細胞最終命運是細胞凋亡。目前已知參與細胞凋亡調(diào)控基因包括c-myc、c-jun、bcl-2、c-fos、ras、p53、bcl-x、bax等,有些促進細胞凋亡,有些抑制細胞凋亡。將抑制細胞凋亡的bcl-2基因?qū)爰毎?bcl-2基因的過量表達可抑制Gln或缺氧引起的細胞凋亡,減少細胞特定營養(yǎng)成分的消耗,提高細胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。已證實bcl-2基因的過度表達可以提高灌流培養(yǎng)中雜交瘤細胞的活性和抗體的生產(chǎn)率。3灌注培養(yǎng)的方法常用的動物細胞培養(yǎng)方法有分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)等。60年代開始的灌注培養(yǎng)技術為動物細胞的高密度大規(guī)模培養(yǎng)開辟了廣闊的前景。在屬于連續(xù)培養(yǎng)方式的灌注培養(yǎng)中,細胞保留在反應器系統(tǒng)中,收獲培養(yǎng)液的同時不斷加入新鮮培養(yǎng)基。灌注培養(yǎng)的主要優(yōu)點是連續(xù)灌注的培養(yǎng)基可以提供充分的營養(yǎng)成分,并帶走代謝產(chǎn)物。同時,細胞保留在反應器中,可以達到很高的細胞密度。同其他方法相比,灌注培養(yǎng)的產(chǎn)率可以提高一個數(shù)量級,并可以大大降低勞動力的消耗。灌注培養(yǎng)主要分為兩大類:懸浮灌注培養(yǎng)和床層灌注培養(yǎng)。懸浮灌注培養(yǎng)是在普通懸浮培養(yǎng)的基礎上,加上一個細胞分離器而成,以微載體懸浮培養(yǎng)加旋轉過濾分離器最為常見。床層灌注培養(yǎng)則把細胞直接保留于床層,不需要分離器,其中堆積床和大孔載體培養(yǎng)的應用較廣。3.1無血清培養(yǎng)基sfm-p動物細胞的大規(guī)模、高密度和長期培養(yǎng),是實現(xiàn)動物細胞產(chǎn)品高效、優(yōu)質(zhì)、低成本生產(chǎn)的前提條件。鄧繼先等在堆積床生物反應器用含5%FBS的DMEM∶F12培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生人促紅細胞生成素(rHuEPO)的細胞8~10d后,使用自制的無血清培養(yǎng)基(SFM-p)生產(chǎn)rHuEPO。SFM-p培養(yǎng)基既能維持細胞生長,又能生產(chǎn)rHuEPO,也便于純化分離rHuEPO。在堆積床生物反應器中細胞附著在圓形聚酯片上生長,培養(yǎng)基不斷通過聚酯片層,細胞大多數(shù)在孔內(nèi)生長,增加了攪拌轉速的調(diào)節(jié)范圍,能供應給細胞充分的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣,細胞的生長條件較溫和。3.2抗尿激酶原和雜交瘤細胞的表達堆積床反應器培養(yǎng)需要準備較多的種子,必須先用轉瓶進行貼壁培養(yǎng),然后用胰酶消化使細胞脫落,以擴大培養(yǎng)規(guī)模。工作量大,增加了污染的機會,限制了工藝的放大。叢春水等采用多孔微載體培養(yǎng)CHO細胞,生產(chǎn)rhEPO。利用細胞可在微載體之間自動轉移的現(xiàn)象,先在200mL攪拌器(Wheaton公司生產(chǎn))中培養(yǎng),待細胞長滿載體時,直接轉入到Celligen2.2L生物反應器(NBS公司生產(chǎn))灌流培養(yǎng),大大簡化了擴大生產(chǎn)規(guī)模的工藝。細胞密度達到1×107mL-1,rhEPO最高可達9.7mg/L,Cytopore微載體(直徑200μm,孔徑30μm)的用量濃度為2.5g/L。在Celligen的1.5L或5L生物反應器中,利用多孔微載體Cytopore和低血清培養(yǎng)基補充成分BIGBEF-3,成功培養(yǎng)了CHO細胞系CL-11G生產(chǎn)尿激酶原和雜交瘤細胞生產(chǎn)抗尿激酶原單克隆抗體。細胞密度可達1×107~2×107mL-1。球轉球方法(beads-to-beads)可以擴大CL-11G細胞培養(yǎng)至BiostatUC20L生物反應器大量生產(chǎn)尿激酶原,也擴大雜交瘤細胞培養(yǎng)生產(chǎn)純化尿激酶原需要的單克隆抗體。通過球轉球方法(beads-to-beads),讓老微載體上的細胞通過球間架橋,轉移到新微載體上,使細胞在新微載體上生長。這種方法操作簡單,污染機會相對較少。以CelliGen5L細胞培養(yǎng)用生物反應器作為種子罐,當Vero細胞生長到一定密度時,將細胞和新的微載體一起移入體積為50L的Cell-Cul-50A細胞培養(yǎng)反應器(華東理工大學研制)中,進行轉球操作,然后進入正常培養(yǎng)階段。整個培養(yǎng)過程為自動控制,溫度控制在(37±0.1)℃,溶解氧為50%空氣飽和度,轉速為20~30r/min。通過換液和灌注的方法,培養(yǎng)8d,細胞密度達到1.1×107mL-1,然后接種狂犬病毒,連續(xù)培養(yǎng)10d,病毒滴度達到國家標準。DeyuKong等用微載體灌流培養(yǎng)CHO細胞生產(chǎn)單細胞集落抑制因子(M-CIF)。開始時,用T形瓶培養(yǎng)細胞,達到80%~90%匯合時以1∶3~1∶4的分配比例進行傳代。然后用轉瓶微載體培養(yǎng)以便進行生物反應器接種,2L微載體培養(yǎng)液接種到15L灌流生物反應器中。頭三天采用分批培養(yǎng)方式,反應器中微載體量為5g/L。第4天開始灌流培養(yǎng)。第8天微載體的裝填量增加到10g/L,第20天時通過補充50%新微載體把微載體的裝填量降低到5g/L,第27天補充第20天時同樣數(shù)量的新微載體。3L(工作體積2L)和15L(工作體積8L)中間裝有旋轉濾器的微載體灌流生物反應器運行兩個多月時間,各收集了60L和300L濾液。灌流培養(yǎng)期間,細胞密度達到2×106~6×106mL-1。重要的是,在非選擇條件下CHO細胞穩(wěn)定表達M-CIF,并保持在4~10mg/L的水平,表達率保持在1.8~3.4mg/106d-1。重組CHO細胞在微載體之間的轉移能力非常有利于微載體培養(yǎng)的擴增和補充新的微載體。3.3動物細胞培養(yǎng)用3.5L、14L、75L攪拌式生物反應器(ChemapAG,瑞士),逐級放大培養(yǎng)WuT3細胞。先用3.5L和14L生物反應器培養(yǎng)WuT3雜交瘤細胞,用人血清代替牛血清培養(yǎng)WuT3細胞,在1%人血清中添加適當成分,可以達到10%小牛血清濃度下的細胞濃度(1.5×106mL-1)和單抗產(chǎn)量(大于50μg/mL)。放大到75L生物反應器中采用半連續(xù)式培養(yǎng),收獲時細胞濃度為1.0×106~1.5×106mL-1,單抗產(chǎn)量為40~70mg/L,平均日產(chǎn)量為1g。采用健康人血清代替牛血清培養(yǎng),上清液經(jīng)分離純化后,制品中人γ蛋白不必進一步除去,對制品的使用不會產(chǎn)生不