豬群中prrsv、ppv和pcv混合感染的復合pcr檢測方法的建立

豬群中prrsv、ppv和pcv混合感染的復合pcr檢測方法的建立

豬環(huán)病毒（pcv）是一種單環(huán)流道病毒，約為1.76k。根據(jù)基因組成及抗原性不同，PCV分為兩種血清型PCV1與PCV2，兩者核苷酸序列同源性為68%～75%。PCV1無致病性，廣泛存在于健康豬群中；PCV2與多種新的豬傳染病的發(fā)生密切相關，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬呼吸道病復合征（PRDC）及豬增生性和壞死性肺炎（PNP）等，其中以PMWS的影響最為嚴重，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。病原學研究表明，PCV-2為PMWS的主要病原，但不是唯一的病原。在PMWS的發(fā)生過程中豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcineparvoductiveandrespiratorydiseasesyndromevirus,PRRSV)及豬細小病毒（Porcinecircovirus,PPV）可能也起著非常重要的作用。動物試驗表明，PRRSV或/和PPV與PCV2混合感染會明顯促進PCV2病毒的復制，從而增強PCV2的致病作用。因此，為了更好地預防和控制PCV2相關疾病，我們需對我國豬群中PCV2與PRRSV或/和PPV混合感染情況有較清楚的認識，以便制定更有針對性的防治措施。為此，本研究在系統(tǒng)分析PCV、PRRSV及PPV基因組的基礎上，分別針對PCV兩種血清型的核苷酸序列、PRRSVORF7基因及PPV的VP2結(jié)構(gòu)基因設計合成引物，分別建立了用于檢測PCV1、PCV2的復合PCR方法和檢測PRRSV、PPV的RT-PCR與PCR方法。應用復合PCR方法先對127份病料進行PCV的檢測。對67份結(jié)果為PCV2陽性的病料再分別進行PRRSV及PPV的檢測，發(fā)現(xiàn)有35份表現(xiàn)為PRRSV陽性，11份表現(xiàn)為PPV陽性。這幾種檢測方法的建立為臨床上進行PCV2、PRRSV及PPV混合感染的流行病學調(diào)查及相關疾病的診斷打下了基礎，同時亦為更好的預防和控制PCV2相關疾病提供了科學依據(jù)。1材料和方法1.1臨床材料及試劑PCV2陽性毒株、PRRSV陽性毒株為本實驗室分離鑒定；PPV陽性毒株由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所惠贈。送檢病料：來源于華東地區(qū)上海、江蘇、浙江及山東等四省市豬場的127份臨床病料，病料采集于臨床表現(xiàn)為呼吸困難，體溫升高及消瘦的患病斷奶仔豬及表現(xiàn)為呼吸困難和繁殖障礙的母豬。取樣前置-80℃凍存。蛋白酶K,RNasin,PCR試劑均購自大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、Trizol為Promega公司產(chǎn)品；PCR儀為AmpGene公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒購自上海生工；其他常規(guī)試劑均為分析純。1.2pcv1和prrsv引物PCV引物：在參考GenBank中公開發(fā)表的PCV1與PCV2基因組核苷酸序列的基礎上，合成以下三條引物。其中引物1,2用于擴增PCV1的基因片段，跨幅為652bp。引物1,3用于特異擴增PCV2基因片段，長度為1154bp。PRRSV引物：在參考美洲代表株VL2332ORF7的基礎上，設計合成了以下2條引物，片段跨幅為整個ORF7，長372bp。引物序列如下：PPV引物：參考PPV基因組主要中和抗原基因VP2中的一段，設計合成了以下2條引物，擴增片段長848bp，引物序列如下：以上引物均由TaKaRa公司合成。1.3t保苯酚法將病豬的肺、脾、淋巴結(jié)等組織充分研磨，-20℃凍融3次，4℃12000r/min離心10min，取500μL細胞懸浮液，加入蛋白酶K至終濃度500μg/mL,SDS至終濃度1%，充分混勻后，置55℃水浴作用30min。然后分別用Tris飽和苯酚（pH8.0）、苯酚：氯仿（1∶1）及氯仿各抽提一次，吸取水相，加1/10體積3mol/LNaAc及2.5倍體積無水乙醇沉淀，-20℃放置2h以上。12000r/min離心15min，沉淀用75%乙醇洗滌，烘干后懸浮于20μL滅菌超純水中。1.4pcr擴增鑒定復合PCR體系：引物濃度為20pmol/μL,dNTPs每種濃度為2.5mmol/L,MgCl2濃度為25mmol/L,rTaq酶為5U/μL，整個PCR體系為50μL。反應成分如下：10×PCRbuffer5μL,dNTPs4μL,MgCl23μL，三個引物各1μL，模板DNA10Μl,rTaq酶0.5μL，加超純水至50μL，混合均勻，將混合物95℃變性10min后，進入PCR循環(huán)，94℃1min,53℃1min,72℃1.5min，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。瓊脂糖電泳鑒定以出現(xiàn)1154bp條帶的為PCV2陽性，652bp的為PCV1陽性，如同時出現(xiàn)上述兩條帶則表示PCV1與PCV2均為陽性。PCR體系：組成為：10×PCRbuffer5μL,dNTPs(2.5mmol/L)4μL,MgCl2(25mmol/L)3μL,2條PPV引物各1μL，模板DNA10μL,rTaq酶0.5μL(5U/μL），加滅菌超純水至50μL，混合均勻，將混合物95℃變性5min后，進入PCR循環(huán)，94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸2min，進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。瓊脂糖電泳鑒定，以出現(xiàn)848bp特異條帶的樣品為陽性。1.5pcr檢測parsv陽性毒株的制備取按步驟1.4制備的500μL組織病料懸浮液上清，加入700μLTrizol混勻，室溫放置10min；加入200μL氯仿，混勻，12000r/min4℃離心10min；吸取水相，再用等體積氯仿抽提一次；將水相轉(zhuǎn)移至另一管中，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置10min后，12000r/min4℃離心10min；沉淀用75%乙醇洗滌，在超凈臺中通風晾干；RNA沉淀溶解于20μL用DEPC處理過的滅菌超純水中。同法制備PRRSV陽性毒株的RNA模板。RT：總體積為20μL，反應體系如下：5×RTbuffer4μL,dNTPs(10mmol/L)2μL,RNasin(40U/μL)1μL,P1,P2各1μL,RNA模板10μL，混勻離心。65℃作用15min，稍冷卻后，加入M-MLV(200U/μL)1μL,42℃1h。95℃作用5min，冷卻后即可進行PCR。PCR:PCR反應總體積為50μL，包括：10×PCRbuffer5μL,MgCl2(25mmol/L)3μL,RT產(chǎn)物10μL,rTaq酶（5U/μL)0.5μL，加超純水至50μL，混勻，將混合物95℃變性5min后進入PCR循環(huán)。參數(shù)設置為94℃1min,51℃1min,72℃1min。進行25個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以出現(xiàn)372bp條帶的樣品為陽性。1.7生化測序及測序分別隨機選取復合PCR、PCR及RT-PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化后直接進行測序，此工作由大連Takara公司協(xié)助完成。應用DNAstar軟件將所測序列與GenBank中發(fā)表的PCV、PRRSV及PPV的相應片段區(qū)域進行同源性分析，進一步證實擴增片段的特異性。2結(jié)果2.1pcv2擴增結(jié)果應用建立的復合PCR方法對來自華東地區(qū)127份臨床組織病料進行PCV檢測，結(jié)果從67份樣品中擴增出PCV2特異條帶，與陽性對照擴增結(jié)果一致。從21份樣品中同時擴增出1154bp和652bp兩條特異條帶，單獨擴增出一條652bp條帶的有7份樣品。電泳結(jié)果見圖1。2.2“典型片段”電泳結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示，67份PCV2陽性樣品中的35份可擴增出372bp的片段，與陽性對照組VL2332株結(jié)果完全相符，部分電泳結(jié)果見圖2。由此可見，待檢樣品中PRRSV與PCV2的混合感染率達52.3%，說明在豬群中PRRSV與PCV2的混合感染已經(jīng)非常普遍。2.3床組織病料ppv的檢測用PCR方法對67份PCV-2陽性的臨床組織病料進行了PPV檢測，結(jié)果從18份待檢樣品中擴增出了PPV848bp的特異條帶，與陽性對照擴增結(jié)果一致（圖略）。2.4序列同源性分析為了進一步確定PCR反應的特異性，各隨機選取復合PCR、PCR及RT-PCR產(chǎn)物純化后進行測序，并對序列進行了同源性分析，結(jié)果顯示，兩個復合PCR產(chǎn)物的序列與GenBank中PCV1毒株AF071879與PCV2毒株AF381177相應區(qū)域的序列同源性分別可達97.9%和98.8%。而PCR和RT-PCR擴增產(chǎn)物與標準毒株的序列同源性均在99%以上，說明擴增產(chǎn)物具有良好的特異性。2pmws癥狀及臨床癥狀PCV2是PMWS的主要病原，但可能不是唯一的病原。PMWS很可能是PCV2與PPV、PRRSV及其它一些病原混合感染的結(jié)果。Pallares等（2002）對369份臨床PMWS病例進行病原分析顯示，PRRSV與PCV2混合感染率達到了51.9%，只感染PCV2的病例僅占1.9%。Pogranichnyy等（2002）對許多病原與PMWS的相關性進行了分析表明，就單個病原而言，PCV2與PMWS的發(fā)生相關性最強，但如果與PRRSV混合感染則PMWS發(fā)生的危險系數(shù)比單獨感染PCV2更高。而且實驗還顯示，健康豬群中PCV2的陽性率也達到了62.5%。因此他們認為PMWS的發(fā)生過程中其它病原如PRRSV可能起著非常重要的作用。Choi等對10個臨床PMWS病例進行PPV檢測，發(fā)現(xiàn)其中4個同時感染有PPV病毒。另外許多動物實驗也證實PPV或PRRSV與PCV2混合感染可產(chǎn)生PMWS癥狀及典型的組織學病變。Krakowka等應用PCV2分離毒株實驗感染未經(jīng)母乳哺育的仔豬或悉生仔豬僅產(chǎn)生輕微的PMWS癥狀，但如將PPV及PCV2共同實驗感染仔豬則可以成功復制出典型的PMWS癥狀及病變，但如用PPV單獨感染沒有任何癥狀和病變。同樣，利用PRRSV與PCV2混合感染仔豬也已成功復制出PMWS典型臨床癥狀及特征性病變。另外最近研究也表明，PCV2與PRRSV混合感染在豬增生性和壞死性肺炎（PNP）的發(fā)生過程中起著關鍵作用。在該項研究中，作者共對192份PNP樣病損的肺樣品進行了檢測，發(fā)現(xiàn)有164份樣品（85.6%）共同存在PRRSV和PCV2。因此可以認為PRRSV或PPV與PCV2的混合感染在PCV2的致病過程起著重要的作用。至今，國內(nèi)尚沒有PRRSV或PPV與PCV混合感染的報道，對豬群中這三種病毒混合感染的情況也很不了解，為此本研究建立了分別用于檢測PCV、PPV與PRRSV的復合PCR、PCR及RT-PCR方法。這幾種檢測方法的建立為臨床上進行PCV2、PRRSV及PPV混合感染的流行病學調(diào)查及相關疾病的診斷打下了基礎，同時也為更好的預防和控制PCV2及其相關疾病提供了科學依據(jù)。應用建立的復合PCR方法對來自華東地區(qū)4省市的127份表現(xiàn)呼吸道癥狀的斷奶仔豬和繁殖障礙母豬病料進行了PCV的檢測，然后應用建立的PCR及RT-PCR方法對67份PCV2陽性病料進行了檢測，發(fā)現(xiàn)比較嚴重的二重感染，其中PRRSV與PCV2二重混合感染占樣品總數(shù)的52.3%；18份樣品表現(xiàn)為PCV2與PPV二重混合感染，占26.9%。另外，還有一定比例的三重感染，共5個樣品，占7.5%。由此可見，豬群中PCV2與PRRSV及PPV混合感染比較普遍，其中尤以PCV2與PRRSV最為嚴重，應該針對此流行現(xiàn)狀采取綜合性的防制措施。P1:5’-C