分子生物學：G H 基因操作

SectionG&HGenemanipulation基因操作

DNACloningDNAcloninginvolvesseparatingaspecificgeneorsegmentofDNAfromitslargerchromosomeandattachingittoasmallmoleculeofcarrierDNA,thenreplicatingthismodifiedDNAthousandsorevenmillionsoftimes.DNAcloning(definition)

DNAcloningistoplacearelativelyshortfragmentinanautonomouslyreplicatingpieceofDNA,knownasavector，formingrecombinantDNA,whichcanbereplicates.PropagationofthehostorganismcontainingtherecombinantDNAformsasetofgeneticallyidenticalorganism,oraclone.ThisprocessiscalledDNAcloning.在基因工程的實際操作中，工具酶的使用是一項基本技術。在體外對DNA進行分離純化、連接重組或者修飾合成等，都會涉及一系列酶促反應。用于基因工程的工具酶種類繁多一、工具酶根據底物分類：DNase、RNase；單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜合雙鏈核酸酶根據催化部位分類：核酸外切酶和核酸內切酶外切酶：5′端→3′端或3′端→5′端核酸外切酶。內切酶：限制性核酸內切酶和非限制性核酸內切酶。1.核酸酶的分類限制性核酸內切酶(restrictionendonucleases)：能夠識別DNA分子的特定核苷酸序列，并在識別位點或其周圍斷開DNA雙鏈的一類核酸酶。三種類型限制酶的主要特性差異比較距識別序列下游24-26bp處識別序列內或附近特異性切割距識別序列1kb處隨機性切割切割位點GAGCCCAGCAG旋轉對稱序列TGAN8TGCTAACN6GTGC識別序列ATP、Mg2+、SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM

輔助因子異源二聚體同源二聚體異源三聚體蛋白結構雙功能單功能多功能限制修飾

Ⅲ型Ⅱ型I型主要特性I型不能用，Ⅲ型酶基本不用，Ⅱ型酶最有用1.2限制性核酸內切酶作用特點來源細菌，只水解外源DNA，可阻止噬菌體對細菌的感染；專一性極高，選擇5－8核苷酸特定序列，切口的序列為回文結構；產生的切口大多為粘性末端，少數為平頭末端。1.3限制性內切酶的命名以EcoRⅠ為例：第一字母：斜體大寫，來自菌種屬名的第一字母；第二、三字母：斜體小寫，來自菌種種名前兩個字母；第四字母：正體大寫，菌株名的第一字母；第五字母：正體大寫，該酶發(fā)現的次序。EscherichiacoliRY13株發(fā)現的第一種酶→EcoRⅠEcoRⅠ切割位點：

5'-GAATTC-3'

3'-CTTAAG-5'序列，切割位點在G與A之間，形成黏性末端。同裂酶（Isoschizomers)：識別位點的序列相同的限制性內切酶。完全同裂酶識別位點和切點完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’HsuI5’-A

AGCTT-3’3’-TTCGA

A-5’1.4同裂酶與同尾酶XmaI5’-C

CCGGG-3’3’-GGGCC

C-5’SmaI5’-CCC

GGG-3’3’-GGG

CCC-5’識別位點相同，但切點不同。如XmaI和

SmaI。不完全同裂酶識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等。5’-G

GATCC-3’3’-CCTAG

G-5’BamHIBclI5’-T

GATCA-3’3’-ACTAG

T-5’5’-A

GATCT-3’3’-TCTAG

A-5’BglⅡ同尾酶(Isocaudamers）同尾酶的粘性末端互相結合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡ限制性內切酶的應用：DNA重組中，供體和載體DNA的切割；DNA的序列測定；繪制限制性圖譜。大腸桿菌DNA連接酶只能催化雙鏈DNA的互補黏性末端，以NAD+為能量。T4噬菌體連接酶黏性、平末端均可連接，以ATP為能量。2.DNA連接酶1）必須是兩條雙鏈DNA。2）DNA3’端有游離的-OH，

5’端有一個磷酸基團（P）。3）需要能量

動物或噬菌體中：ATP

大腸桿菌中：NAD+2.1連接條件10～20倍。增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現象。1)插入片段與載體的濃度比例

2)反應溫度一般14-16℃3)酶用量2.2影響連接反應的因素來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）5’pOH3’DNAorRNAOH3’5’HO3.堿性磷酸單酯酶功能：催化核酸脫5`-磷酸基團，使DNA或RNA片段5`-P末端轉換成5`-OH末端。5’p3’HOOH3’p5’堿性磷酸酶5OH3’HOOH3’OH5’5’p3’HOOH3’p5’堿性磷酸酶5OH3’HOOH3’OH5’活性:催化粘性末端或平端脫5`-磷酸基團4.DNA聚合酶常用的聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修飾過的T7DNA聚合酶逆轉錄酶催化以DNA為模板合成DNA的一類酶。DNA聚合酶3’

5’外切酶活性5’

3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高常用DNA聚合酶的特性比較基本性質：5’→3’的DNA聚合酶活性5’→3’的核酸外切酶活性3’→5’的核酸外切酶活性4.1E.coliDNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶；Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。4.2E.coliDNA聚合酶I大片段(Klenow)基本用途補平由核酸內切酶產生的5’粘性末端DNA片段的同位素末端標記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列5.1單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’5.核酸酶ExoVⅢ3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3’端外切5.2雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）lExoMg2+Ⅰ核酸外切酶特異性地從5’端外切3’5’3’5’雙鏈核酸外切酶：Ⅰ核酸外切酶(ⅠExo)3’5’3’5’在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA雜交S1EcoRI單鏈核酸內切酶：核酸酶S1內切帶切口或缺口的雙鏈DNA或RNA來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌。T4-PNP催化γ-磷酸從ATP分子轉移給DNA、RNA的5’-OH末端。用于探針的末端同位素標記，使缺失5`-P末端的DNA發(fā)生磷酸化作用5’HO3’HOOH3’OH5’T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5’p323’HOOH3’6.T4多核苷酸激酶p325’催化DNA片段，逐個將dNTP分子加到線性DNA分子3`-OH端，合成方向，5’→3’。不需要模板DNA，隨機摻入dNTPs；給外源DNA片段及載體分子加上互補同聚物尾巴；標記DNA片段的3’末端。7.末端轉移酶5’p3’HOOH3’p5’Co2+

dATP5’p3’HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

OH3’p5’5’p3’HOOH3’p5’Co2+

dATP5’p3’HOAAAAAAAAAAAAAAOH3’p5’AAAAAAAAAAA例：Co2+催化作用8.TaqDNA聚合酶

分離自水生棲熱菌，分子量為94,000，最適反應溫度72℃，對95℃高溫具良好穩(wěn)定性，該酶不存在3’→5’外切酶活性

主要用于DNA的體外擴增，一個DNA分子因而可被擴增4×106倍

DNA擴增技術又稱為聚合酶鏈式反應

PCR的原理引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段ingThefirstthreecyclesofPCRPCR的指數擴增（2n）基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈反轉錄酶Mg2+dNTP3’AAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTT

oligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTT3’cDNA9.反轉錄酶雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’

5’

DNA3’基本特性

RNaseH10.RNase用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA樣品或蛋白質合成系統(tǒng)中的RNA分子。RNaseA分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（100℃加熱15min仍具活性）,用于除去DNA樣品中的RNA分子。如：提質粒時除RNA。11.RNaseH

作用于DNA-RNA雜交分子中的RNA鏈，用于cDNA文庫建立時除去RNA鏈以便第二條鏈cDNA鏈的合成。

12.DNaseI具內切酶活性，作用于dsDNA，但無核苷酸序列特異型，當酶濃度很低時，ds-DNA分子上將形成切口用途

1)制備RNA樣品時除去DNA分子

2)制備DNA探針時，在dsDNA上產生切口

3)基因突變時產生切口

Mn2+存在時

Mg2+存在時

DNaseI作用特點DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI與PolI的切口移位PolI二、HostsandvectorsHostorganism/cell:

wheretheplasmidsgetmultiplied增殖

andpropagated繁殖

faithfully,whichiscrucialforDNAcloning.HostsforDNAcloningvector

Prokaryotichost:E.coli(mostcases) Eukaryotichost:YeastSaccharomycescerevisiae釀酒酵母(largefragmentsofhumangenome)GeneralfeaturesofaVectorautonomouslyreplicatingDNA

independentofhost’sgenome.Easilytobeisolated

fromthehostcellMostarecircular,somearelinearContainsatleastone

selectivemarker,whichallowshostcellscontainingthevectortobeselectedamongstthosewhichdonot.Containsa

multiplecloningsite(MCS)TypesofvectorsCloningvectors

克隆載體Expressionvectors

表達載體Integrationvectors

整合載體Cloningvectors:

allowingtheexogenousDNAtobeinserted,stored,andmanipulated操作

atDNAlevel.Expressionvectors:

allowingtheexogenousDNAtobeinsertedandexpressed.PromoterandterminatorforRNAtranscriptionarerequired.bacterialexpressionvectorsyeastexpressionvectorsmammalianexpressionvectorsIntegrationvectors整合載體:

allowingtheexogenousDNAtobeinsertedandintegratedintoachromosomalDNAafteratransformation轉化.Theintegrationisconductedbyhomologousrecombinationbetweenthehomologoussequencesharedbytheplasmidandthegenomeoftherecipient(受體)cells.bacterialintegrationvectors(Agrobacteriumtumefaciens根癌農桿菌

TiplasmidisusedtointegrateDNAintoplantgenome)yeastintegrationvectorsMammalianintegrationvector:virusbasedG2質粒DNA的制備質粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb）的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。常有一些對宿主有利的酶的編碼基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產生抗生素、限制酶、修飾酶等質粒的復制：嚴緊型復制（1-n個）松弛型復制（20個以上）質粒的不親合性也稱為質粒的不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關系密切的不同質粒，不能夠在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現象。質粒的不親合性分子基礎，主要是由于它們在復制功能之間的相互干擾造成的。常用的質粒載體是通過DNA重組技術構建而成的。pUC18/pUC19Ampr抗性基因編碼β-內酰胺酶可特異地切割Amp的β-內酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力pUC質粒載體的優(yōu)點具有較小的分子量和更高的拷貝數;平均每個細胞500~700個拷貝。具有多克隆位點MCS區(qū)段；方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。適用于組織化學檢測重組體；具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的α-肽鏈可參與α-互補作用，用Xgal顯色對重組子進行鑒定。外源片段插入到多克隆位點后,表達蛋白（β-半乳糖苷酶）失活,含重組質粒的轉化子在生色誘導培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。質粒DNA的提取在pH12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質粒DNA仍為自然狀態(tài)；將pH調至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網狀結構，大部分DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，質粒DNA仍可溶；通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質粒DNA。提取的質?？捎腥N結構：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。苯酚/氯仿分離蛋白質和核酸法按氯仿:異戊醇＝24:1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現的泡沫。按體積/體積＝1:1混合飽和酚與氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿的各自作用酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大于氯仿，按道理應該用酚來最大程度將蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；酚和氯仿的各自作用酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收!乙醇沉淀DNA回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質粒DNA沉淀出來。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。CsCl密度梯度離心瓊脂糖凝膠電泳

相關知識天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose，約占80％）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷。瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象，加之硫酸根可與某些蛋白質作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍

核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。核酸為兩性分子，在堿性環(huán)境下，堿基幾乎不解離，整個分子帶負電。相同堿基數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負電荷，能以同樣的速度向正極方向移動。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關系，可以近似用于估算分子的大小?？梢苑蛛x相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子。cccDNA＞直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。影響遷移率的因素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構象、所加電壓（一般5V/cm）、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等。Agrosegelelectrophoresis-veelectrode+veelectrodeNegativelychargedDNA常用染料EB:溴化乙錠（EthidiumBromide，EB），EB能插入DNA分子堿基對之間，導致EB與DNA結合。DNA吸收的260nm的紫外光傳遞給EB，或者結合的EB本身在300和360吸收的射線，均可在可見光區(qū)以590波長發(fā)射出來，呈橙紅色。EB染料優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以加到樣品中，也可加到膠中。EB是誘變劑，使用時一定要戴手套。EB廢液要經過處理才能丟棄。SYBR、Goldview:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價格較昂貴。圖1的電泳結果不是很好，一方面上樣量太大不同構象的質粒分子沒有分開；另一方面有些樣品RNA去除得不好，在電泳結果上可以看到大團的熒光；此外還要注意上樣的技巧，上樣后稍沉降一會，使樣品均勻地分布于上樣孔的底部再開始電泳，這樣走出的條帶會較均勻。圖3的結果較好。AgrosegelelectrophoresisIsolationoffragmentsandAgarosegelelectrophoresisinsertRestrictiondigestionAgarosegelelectrophoresis3. GelexcisionandpurificationLigationwithvectortransformationAgroseGelElectrophoresis:瓊脂糖凝膠電泳checkyourDNAateachstepSeparationandPurificationofDNAfragmentsofinterestsAnalysisofrecombinantplasmidsRestrictionanalysisofaplasmid1234562.穿梭質粒載體（shuttleplasmidvector

）是指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細胞存活和復制的質粒載體。例：大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質粒載體大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質粒載體大腸桿菌-牛乳頭瘤病毒！迄今還沒有發(fā)展出適用的大腸桿菌-植物細胞穿梭載體3.λphage48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)

溶菌階段(復制和釋放)溶源階段

(整合到寄主染色體上) 5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephage

cosendsCircularformLinearformcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bpλ替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對于噬菌體的感染和復制非必要的片段(約20kb)高感染效率(109

轉化株/ug載體DNA,比質粒高100-倍)λ置換型載體2.組裝連接3.侵染λ噬菌體包裝λ噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的DNA，要求λ載體和外源DNA長度之和在39～53kb之間。插入式載體可攜帶的外源DNA片段較替換式為小4.單鏈DNA噬菌體載體(M13)M13噬菌體的特點M13是一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。感染Ecoli后，在宿主細胞內會形成雙鏈的復制型DNA（replicationformDNA,RFDNA）?？梢韵筚|粒DNA那樣在體外進行純化和操作。獲得大量的單鏈DNA片段，主要用來DNA測序、定點突變、異源雙鏈DNA的分析等。M13單鏈DNA噬菌體的生命周期RFDNAM13克隆載體分子結構圖5.黏粒載體（柯斯質粒載體）cosmid載體：也稱黏粒、柯斯載體。一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。不會產生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于細胞內。設計構建的柯斯質粒一般長4～6kb。cos位點可識別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點的任何DNA分子只要在長度相當于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結合而被包裝成類似噬菌體λ的顆粒。因此，插入柯斯質粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質?？上笫删wλ一樣感染大腸桿菌，并在細菌細胞中復制。DigestionLigationC)PackagingandinfectFormationofacosmidcloneLigationtocleavedcosmidvectormoleculescanproducevector-targetconcatemers,resultinginalargeexogenousDNAfragmentflankedbycossequences.酵母人工染色體載體（yeastartificialchromosome,YAC）細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒、腺病毒相關病毒、逆轉錄病毒）人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫，要求有容量更大的載體。酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應運而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(centromere)及復制起點等功能序列，可插入長度達200-500kb的外源DNA6.酵母人工染色體酵母人工染色體含有：*四膜蟲端粒（tel)*酵母自主復制序列（ARS)*酵母著絲點(CEN)*酵母的選擇標記(TRP1、URA1)YAC載體7.BAC載體三、RecombinantDNATechnology

DNA重組技術IsolationoftargetgeneSelectionandconstructionofvectorsLigationoftargetDNAandvectorTransformationoftargetgeneintoreceptorcellScreeningforrecombinantplasmidsExpressingaclonedgene

Processofcloning基因克隆研究程序

ProcessofDNAcloning

1.IsolationoftargetgeneChemicalsynthesis：onlyforsimplepolypeptidechainwhoseprimarystructureisclear.ObtainingfromgenomicDNAlibraryObtainingfromcDNAlibrarypolymerasechainreaction(PCR)

Afewcommonlyusedvectors：plasmidphagecosmidyeastartificialchromosome(YAC)2.Selectionandconstructionofvectors質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體真核細胞克隆載體

LigationoftargetDNAandvectors1.Ligationofstickyend

2.Ligationofbluntends3.Theadditionofahomopolymertail

AddingasequenceofDNAfragment,whichcontainsthecleavagesiteforrestrictionendonuclease.

4.ArtificiallinkerArtificiallinker

In