第02章-酶分析法

第二章酶分析法第一節(jié)酶分析法的基本知識1.1酶分析法的兩種類型1.2酶分析法的特征1.3酶分析法的意義第二章酶分析法第一節(jié)酶分析法的基本知識第二節(jié)酶活力的測定第三節(jié)酶法分析第四節(jié)酶循環(huán)分析法第五節(jié)固定化酶在酶分析中的應(yīng)用蛋白質(zhì)屬性的酶是高效、高度專一的生物催化劑，它和生命活動密切相關(guān)。因此，酶學(xué)在生產(chǎn)實踐基礎(chǔ)理論研究方面，都起著非常重要的作用。酶分析法則是其中的重要內(nèi)容，也是目前發(fā)展較為迅速的一個領(lǐng)域。酶的選擇性及其在低濃度下能催化底物反應(yīng)的能力，對化學(xué)分析有很大的用處。酶的催化反應(yīng)早已用于底物、激活劑、抑制劑以及酶本身的測定。在19世紀(jì)中葉已采用酶法來測定糖類。20世紀(jì)40年代初，Warburg提出基于使輔酶還原而用光度法來測量NAD和NADP的方法。最新的發(fā)展是電化學(xué)法與熒光法的應(yīng)用。酶分析法已成為一項公認(rèn)的分析技術(shù)。1.1酶分析法的兩種類型一種是以酶作為分析對象，根據(jù)需要對樣品進行酶含量或活力的測定，通常稱為“酶活力測定”。另一種是以酶作為分析試劑，用以測定樣品中用一般化學(xué)方法難于檢測的物質(zhì)，如酶的底物、抑制劑、活化劑和輔因子等，一般稱為“酶法分析”。兩者檢測的對象雖有所不同，但原理和方法都是以酶能專一而高效地催化化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶反應(yīng)速度的測定來檢測相應(yīng)物質(zhì)的含量。并且都需要選擇適宜的反應(yīng)條件和測定方法。1.2酶分析法的特征①選擇性高。原則上講，一種酶只催化一種反應(yīng)，或者說只能催化某種特定的化合物或?qū)μ囟ǖ幕瘜W(xué)鍵起作用。這是由酶本身的高度專一性作用的特點所決定的。②靈敏度高。一般可測到10-7mol/L。如果與熒光法聯(lián)用，可高達(dá)10-9mol/L左右。③反應(yīng)速度快，條件溫和。大多數(shù)酶促反應(yīng)在30分鐘以內(nèi)可以完成。反應(yīng)條件很溫和，如在常溫、常壓和pH近中性的條件下，反應(yīng)速度很快。④酶用量甚微，所以比較經(jīng)濟。⑤精確度一般。主要源于微量吸管誤差，如1ul以下的量，取樣誤差較大。同時也與組合方式有關(guān)。⑥適用范圍有一定局限性。只限于酶、底物、輔酶、活化劑或抑制劑的測定。⑦簡便程度較差。必須具有酶學(xué)知識的操作訓(xùn)練，通常要求盡量減少人為誤差，盡可能使所有反應(yīng)體系條件一致。如加樣量、溫度、反應(yīng)時間等都要求比較準(zhǔn)確。最適反應(yīng)條件(如溫度、pH等)的確定很重要，一個熟練的酶學(xué)工作者，會考慮各種因素，設(shè)計的實驗比較合理，而且重現(xiàn)性好；未經(jīng)過專門訓(xùn)練的人，往往容易出錯。1.3酶分析法的意義酶的應(yīng)用大致可分為四個方面：(1)用以制造某些產(chǎn)品；(2)用以去除某些物質(zhì)；(3)用以識別某種化合物；(4)用以測定某種物質(zhì)。(1)和(2)應(yīng)用最為廣泛。例如用酶法生產(chǎn)可的松，用凝乳酶制造乳酪，用果膠酶澄清果汁等。(3)和(4)屬于酶分析法的范疇。酶分析法迅速擴展一個原因是由于酶工業(yè)的發(fā)展，可以方便獲得各種酶制劑。第二個原因提由于酶應(yīng)用形式的發(fā)展。由于近十年來酶的固定化技術(shù)有了很快的發(fā)展，使酶的反復(fù)使用和連續(xù)使用成為可能。固定化酶的品種已有不少，它們一方面和自動化測定技術(shù)相結(jié)合，促使酶自動化分析法的迅速普及。另一方面也正在進一步簡便化，或制成含酶的試紙，或制成酶試劑包出售，一般只需要加一定量的水就可以直接使用。酶分析法正在臨床診斷、食品加工和發(fā)酵等方面廣泛應(yīng)用。如用葡萄糖氧化酶(EC．1．1．3．4)測定血液葡萄糖是臨床檢驗中常用的方法，而測定某些酶含量也是臨床診斷的重要指標(biāo)。第二節(jié)酶活力的測定2.1酶活力單位和反應(yīng)初速度2.2反應(yīng)條件的確定2.3測定方法1.酶活力的概念2.酶活力的測定方法2.1酶活力單位和反應(yīng)初速度2.1.1酶量常用酶活力單位表示。酶活力單位是指在某一特定條件下，使酶反應(yīng)達(dá)到某一速度所需要的酶量。酶含量則可用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來表示(U/g或U/mL)。①1959年國際生物化學(xué)協(xié)會酶委會接受了Racker等人的建議，采用了“國際單位”表示酶活力。國際單位IU：25℃，最適pH，最適底物濃度下，每分鐘催化1μL底物反應(yīng)的酶量。當(dāng)?shù)孜餅榈鞍踪|(zhì)、多糖等包括多個能被酶作用的鍵或基團時，可用催化一個微摩爾被作用的基團或鍵變化表示酶單位；對于反應(yīng)：A+B→C+D，可用兩微摩爾A的變化計算酶單位。②1972年酶委員會又提出一種新單位Katal。在確定的最適反應(yīng)條件下每秒鐘催化1摩爾底物變化所需要的酶量為1Kat。1Kat=60×106IU。③在實際工作中,為了簡便，人們往往采用各自習(xí)慣沿用的單位。有時甚至可直接用測得的物理量表示。如以光吸收的變化值(△A/△t)表示酶單位。④在估計酶制劑純度時則用比活力，即以單位重量的酶蛋白中酶的單位數(shù)⑤在酶高度純凈，且酶的分子量和每個酶分子上的活性中心數(shù)目已知時，可采用分子活力或轉(zhuǎn)換率(TN)表示。TN表示在最適條件下每個酶分子或每個活性中心每分鐘催化底物分子(或相關(guān)基團)轉(zhuǎn)化的數(shù)目，這種單位的意義是它可用以進行酶催化效率的估計和比較。2.1.2反應(yīng)初速度酶促反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示。以產(chǎn)物或底物變化量對時間作圖，可獲得“酶反應(yīng)進程曲線”，這條曲線的斜率就代表酶反應(yīng)速度。酶活力測定的目的就是要通過酶反應(yīng)速度的測定求得酶的濃度或含量。測得的反應(yīng)速度必須和酶濃度間有線性的比例關(guān)系，這是檢驗酶反應(yīng)和測定系統(tǒng)是否適宜、正確的標(biāo)準(zhǔn)。2.2反應(yīng)條件的確定選擇反應(yīng)條件的基本要求是，所有待測定的酶分子都應(yīng)能正常地發(fā)揮作用。也就是說，反應(yīng)系統(tǒng)中除了待測定的酶濃度是影響反應(yīng)速度的唯一因素外，其它因素都應(yīng)處于最適條件。2.2.1底物①底物(包括人工合成底物)最好在物理化學(xué)性質(zhì)上和產(chǎn)物不同。有些酶作用的底物和產(chǎn)物本身就有這種特點，如脫氫酶用的NAD(P)+和NAD(P)H；有的則需加工成色源或熒光源底物，在酶作用后產(chǎn)物產(chǎn)生顏色或熒光。如磷酸酯酶測定可用對硝基苯磷酸。②底物濃度為了使酶反應(yīng)速度不受它的限制，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)該使用足夠高的底物濃度。判別標(biāo)準(zhǔn)是Km例如選用[s]=100Km，因為這種情況下反應(yīng)速度可達(dá)最大速度的99％。大多數(shù)酶具有相對的專一性。在可被它作用的各種底物中一般選擇Km小的作測定用的底物。③底物表現(xiàn)高底物濃度抑制，或者溶解度小，或者具有毒性，或者較為昂貴而不能使用高濃度，同時又沒有其它適宜的底物可以替用時，就只能根據(jù)具體的條件，選擇一個恰當(dāng)?shù)牡孜餄舛?。并確定在該濃度條件下酶反應(yīng)的動力學(xué)級別。如：酵母的蔗糖酶受高濃度蔗糖抑制，故一般測定時選用5％左右的蔗糖濃度，此時反應(yīng)為零級。2.2.2pH值H+能對酶反應(yīng)產(chǎn)生多種影響：①可能改變酶活性中心的解離狀況，升高或降低酶的活性；②可能破壞酶的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象導(dǎo)致失效；③可能作用反應(yīng)系統(tǒng)的其它組成成分影響酶反應(yīng)，甚至改變可逆反應(yīng)進行的方向。如：乳酸脫氫酶反應(yīng)在pH7時向乳酸生成方向進行，而pHl0時則傾向于丙酮酸的形成。在進行酶活力測定時要注意選擇適宜的反應(yīng)pH，并將反應(yīng)維持在這一范圍內(nèi)。有些酶反應(yīng)的最適pH可能因反應(yīng)的溫度與底物濃度而不同。例如，堿性磷酸酯酶的最適pH在25℃、30℃和37℃分別為10.3、10.1和9.9。酶反應(yīng)緩沖系統(tǒng)的離子的pK值應(yīng)接近要調(diào)整的pH。①磷酸緩沖液適用于pH低于7.5的反應(yīng)系統(tǒng)，②Tris(三羥甲基氨基甲烷)緩沖液適用于高于pH7.5的反應(yīng)體系。③Gly-Gly(甘氨酸二肽)在pH大于8時是出色的緩沖系統(tǒng)。緩沖離子不同，可能影響酶的活性水平，甚至最適pH。緩沖離子也可能與酶活性的必需成份形成配合物而導(dǎo)致酶活性的抑制。如，磷酸能與多價陽離子如Ca2+

等結(jié)合，硼酸能與多種有機化合物如呼吸鏈中間遞體結(jié)合，從而抑制相應(yīng)的酶活性。2.2.3溫度直接影響化學(xué)反應(yīng)速度本身，也能影響酶的穩(wěn)定性，還可能影響酶的構(gòu)象和酶的催化機制。溫度變化1℃，速度可能相差10％以上。要得到可以高度重復(fù)的結(jié)果，溫度變動應(yīng)控制在±0.1℃以內(nèi)。生化聯(lián)合會在1961年建議以25℃為酶的反應(yīng)測定溫度，到1964年則建議改為30℃；國際臨床化學(xué)聯(lián)合會也建議采用30℃。但是許多臨床化學(xué)工作者常采用37℃為酶反應(yīng)溫度。2.2.4輔助因子有些酶需要金屬離子有些酶則需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)，在反應(yīng)系統(tǒng)中應(yīng)該滿足酶對這些輔助因子的需要，而且在添加這些物質(zhì)時還應(yīng)注意到它們的專一性，以及某些活化劑在高濃度時可能產(chǎn)生抑制作用。為了提高酶在反應(yīng)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有時也需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。例如，對巰基酶可加入巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)等。在制備樣品和反應(yīng)過程中為了避免待測酶遭受蛋白酶的降解，往往要加入蛋白酶的抑制劑。2.2.5樣品許多待測樣品常常包含各種干擾因素，如可能存在著作用同一底物或產(chǎn)物的其它酶。因此測定前應(yīng)檢測系統(tǒng)中是否雜有這些干擾因素。同時采用不同的測定方法和同時檢測底物和產(chǎn)物的變化量，然后觀察測得的結(jié)果是否一致。通過這些比較分析，確定是否存在干擾。例：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)或谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)可催化氨基的轉(zhuǎn)移。①測定方法是偶聯(lián)一個脫氫酶反應(yīng)。前者可偶聯(lián)乳酸脫氫酶(LDH)，后者可偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶(MDH)，然后測定反應(yīng)過程中NADH在340nm光吸收的降低。②在這些測定樣品中，如果包含有谷氨酸脫氫酶(GluDH)，那么就可能產(chǎn)生干擾。反應(yīng)平衡傾向于形成L-Glu，它同樣導(dǎo)致340nm光吸收下降。GluDH在正常血清中極少，在腦、肝等組織中極為豐富。在某些病理條件下血清中這種酶活性可能顯著升高。該酶反應(yīng)需要NH4+而且其Km很大，如果反應(yīng)系統(tǒng)能夠避免NH4+，那么這種干擾就可消除。同時進行空白試驗。2.2.6空白和對照空白是指雜反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，它提供的是未知因素的影響?？瞻字悼赏ㄟ^不加酶，或不加底物，或二者都加，但酶預(yù)先經(jīng)過失效處理的反應(yīng)系統(tǒng)獲得。對照是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測得的結(jié)果，主要作為比較或標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)。2.3測定方法測定方法有取樣法和連續(xù)法。取樣法：在酶反應(yīng)開始后不同的時間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量的反應(yīng)液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞磻?yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差別進行分析，求得單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)變化量的方法。連續(xù)法：基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反應(yīng)過程中對反應(yīng)系統(tǒng)進行直接、連續(xù)觀察的方法。2.3.1光吸收測定法根據(jù)產(chǎn)物和底物在某一波長或某一波段上，有明顯的特征吸收差別而建立起來的連續(xù)觀測方法。①光吸收測定法應(yīng)用的范圍很廣。幾乎所有氧化還原酶都可用此法測定。例1：脫氫酶的輔酶NAD(P)H在340nm有吸收高峰，而氧化型則沒有。例2：細(xì)胞色素氧化酶的底物為細(xì)胞色素c，該物質(zhì)在還原態(tài)時，其550nm的吸光系數(shù)2.81×104厘米2/摩爾，而氧化型的0.80×104厘米2/摩爾。這種光吸收差別也可用來進行測定。某些氧化還原酶難以獲得天然的供受體，可采用簡單的人工供受體(見下表)。②可以利用光吸收測定的-還有那些催化雙鍵飽和化或雙鍵形成的酶反應(yīng)，以及那些催化環(huán)狀結(jié)構(gòu)變化的酶反應(yīng)。例1：延胡索酸酶催化的反應(yīng)，延胡索酸在300nm有強的光吸收，而蘋果酸沒有。例2：尿酸氧化酶催化尿酸氧化為尿囊素，尿酸在290nm有吸收，而尿囊素則沒有。光吸收測定法的特點是靈敏度高(可檢測到nmol/L水平的變化)，簡便易行，測定一般可在較短的時間內(nèi)完成。光吸收法，應(yīng)用很廣，除上述氧化還原酶，許多激酶(轉(zhuǎn)移酶)、酯酶、肽酶等，都廣泛采用這類方法。2.3.2熒光測定法如果酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物具有熒光，則熒光強度變化速度可作為酶反應(yīng)速度的一個量度?？梢詰?yīng)用此法測定酶的反應(yīng)有兩種：一是脫氫酶等反應(yīng)，它們的底物本身在酶反應(yīng)過程就有熒光變化。例如NAD(P)H的中性溶液發(fā)強的藍(lán)白色熒光(460nm)，而NAD(P)+則沒有。另一類是最近發(fā)展起來的，利用熒光源底物的酶反應(yīng)，例如可用二丁酰熒光素測定脂肪酶，二丁酰熒光素不發(fā)熒光，但其水解后釋放熒光素。熒光測定法優(yōu)點：靈敏度極高，它比光吸收測定法還要高2~3個數(shù)量級，因此特別適于酶量或底物量極低時的快速酶分析。與此有關(guān)的是熒光光譜與熒光偏振測定。二者近年來廣泛用于酶作用機制的研究。熒光測定法缺點熒光讀數(shù)與濃度問沒有直接的比例關(guān)系。而且常因測定條件如溫度、散射、儀器等而不同。所以如果要將酶活性以確定的單位表示時，首先妻制備校正曲線，根據(jù)這曲線再確切定量。該法易受其它物質(zhì)干擾。有些物質(zhì)如重鉻酸鉀常會搶奪能量，降低熒光強度；有些物質(zhì)如蛋白質(zhì)能吸收和發(fā)射熒光，這種干擾在紫外光區(qū)尤為顯著，故測定的熒光最好是可見光、特別是紅熒光為好。2.3.3電化學(xué)測定法靈敏度和準(zhǔn)確度都很高，可和光學(xué)方法相比。測定系統(tǒng)中有某些物質(zhì)污染，不會影響結(jié)果。此法要求一定的儀器設(shè)備。①離子選擇性電極測定法最普通的是以玻璃電極測定酸度(pH)的變化?？捎糜诋a(chǎn)酸反應(yīng)的測定。此法操作簡單，但有兩個缺點：一是隨著反應(yīng)的進行，pH不斷改變，酶活力也將發(fā)生變化；二是測定系統(tǒng)的pH依賴于介質(zhì)的緩沖能力，蛋白質(zhì)是高緩沖性物質(zhì)，粗的待測樣品中往往包含大量惰性蛋白，因而難以保證恒定的緩沖強度，測定結(jié)果不易準(zhǔn)確。連續(xù)滴定或恒酸滴定可以克服上述困難。所謂恒酸滴定就是在反應(yīng)過程中，不斷向反應(yīng)系統(tǒng)加酸或堿使pH維持恒定，同時以加酸或加堿的速度代表反應(yīng)速度。恒酸滴定儀(pH-stat)就是適應(yīng)這種需要而設(shè)計的一種精密測定儀。它可自動加酸加堿控制pH，并記錄加入的酸堿量與時何的關(guān)系。②氧電極測定法原理：給水溶液中的電極加上一定電壓，其中的溶解物質(zhì)在電極上進行氧化還原反應(yīng)；產(chǎn)生電解電流。根據(jù)電流測定溶質(zhì)濃度。各種物質(zhì)產(chǎn)生電極反應(yīng)所需要加的電極電壓是不同的。可以進行選擇性測定，例如，溶解氧能在較低的負(fù)電壓(0.65V左右)條件下還原，而能在這種電極電壓水平下發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)又很少，因此可用來測定氧化還原反應(yīng)，如葡萄糖氧化酶、氨基酸氧化酶等，不過這種方法主要用于線粒體和光合成酶系的研究。③電流測定法原理：把兩個電極浸入分析樣品中，其間維持一恒定電壓，這樣反應(yīng)過程中電流的變化速度將反映酶反應(yīng)的速度。例：測定葡萄糖氧化酶反應(yīng)過程中管狀鉑電極上發(fā)生的Fe2+氧化導(dǎo)致電流的變化，這種變化和酶反應(yīng)速度間有線性關(guān)系。2.3.4放射化學(xué)測定法放射化學(xué)測定法的原理和化學(xué)法相似，不過底物用同位素標(biāo)記。隨著酶催化反應(yīng)進行，將定量地導(dǎo)致放射標(biāo)記的產(chǎn)物形成。一定時間后，將反應(yīng)停止并將產(chǎn)物和底物加以分離，然后測定產(chǎn)物的放射性或未反應(yīng)的底物的放射性，那么轉(zhuǎn)化的底物量也就能推算出來。此法檢測的靈敏度可以通過反應(yīng)時間的控制、比放射性的選擇而適當(dāng)調(diào)整。已知的六大類酶幾乎都可以用此法測定。通常用于底物標(biāo)記的同位素有。H、14C、32P、35S和131I它們在衰變過程中放射的都是β粒子。用于酶分析中的底物，其比放射性一般不宜太高，因為這樣可以降低分析成本，避免干擾，減少誤差。32P、131I等產(chǎn)生的高能β-射線，可直接用Gerger·miiller。計數(shù)器探測計數(shù)。但是低能的β-射線(如來自3H、35S)則常用液體閃爍儀檢測。放射化學(xué)檢測法的特點是靈敏度極高，高于光學(xué)和電學(xué)等方法。可直接用于酶活性檢測，也可用于體內(nèi)酶活性測定。缺點是操作較繁而費時，每個測定都必須進行分離，其次同位素的保存和操作必須特別小心，它直接關(guān)系到使用者的健康、安全；另外此法不能進行連續(xù)跟蹤，故測定時反應(yīng)時間不能太長，應(yīng)使底物的轉(zhuǎn)變落在初速度范圍內(nèi)；最后一個問題是輻射線的淬滅，例如。H發(fā)射的β-射線可被紙吸收。總的來說，放射化學(xué)測定法是一種重要的測定方法。它的應(yīng)用愈來愈廣、愈多，有些酶反應(yīng)目前還只能采用此法測定。同位素在酶分析上的其它應(yīng)用可參考有關(guān)專著。2.3.4放射化學(xué)測定法原理：底物用同位素標(biāo)記。隨著酶催化反應(yīng)進行，將定量地導(dǎo)致放射標(biāo)記的產(chǎn)物形成。一定時間后，將反應(yīng)停止并將產(chǎn)物和底物加以分離，然后測定產(chǎn)物的放射性或未反應(yīng)的底物的放射性，那么轉(zhuǎn)化的底物量也就能推算出來。此法檢測的靈敏度可以通過反應(yīng)時間的控制、比放射性的選擇而適當(dāng)調(diào)整。已知的六大類酶幾乎都可以用此法測定。通常用于底物標(biāo)記的同位素有。3H、14C、32P、35S和131I它們在衰變過程中放射的都是β粒子。用于酶分析中的底物，其比放射性一般不宜太高，因為這樣可以降低分析成本，避免干擾，減少誤差。32P、131I等產(chǎn)生的高能β-射線，可直接用Geigermiiller計數(shù)器探測計數(shù)。但是低能的β-射線(如來自3H、35S)則常用液體閃爍儀檢測。優(yōu)點：靈敏度極高，高于光學(xué)和電學(xué)等方法。缺點：①操作較繁而費時；②同位素的保存和操作必須特別小心，它直接關(guān)系到使用者的健康、安全；③不能進行連續(xù)跟蹤，故測定時反應(yīng)時間不能太長，應(yīng)使底物的轉(zhuǎn)變落在初速度范圍內(nèi)；④輻射線的淬滅問題，如3H發(fā)射的β-射線可被紙吸收。放射化學(xué)測定法是一種重要的測定方法。它的應(yīng)用愈來愈廣、愈多，有些酶反應(yīng)目前還只能采用此法測定。2.3.5酶偶聯(lián)分析法應(yīng)用過量、高度專一的“偶聯(lián)工具酶”，使被測酶反應(yīng)能繼續(xù)進行到某一可直接、連續(xù)、簡便、準(zhǔn)確測定階段的方法。1．酶偶聯(lián)分析測活力的實例：例1：如果被測酶反應(yīng)的產(chǎn)物是某脫氫酶的底物，在這種情況下，可向反應(yīng)測定系統(tǒng)中．加入足夠量的相應(yīng)的脫氫酶和輔酶，使反應(yīng)繼續(xù)進行，然后通過NAD(P)H特征吸收變化而加以測定。其中G和G-6-P-O分別代表葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸-δ內(nèi)酯)大約有50種左右的脫氫酶可以利用NAD+和NADH，20多種脫氫酶能利用NADP+或NADPH。它們都可用作偶聯(lián)指示酶。如：己糖激酶(HK)的測定就可在過量的葡萄糖-6-磷酸(G-6p)脫氫酶(G6PDH)和NADP+存在的條件下進行：例2：被測反應(yīng)不能直接和上述脫氫酶反應(yīng)偶聯(lián)，可再插入一個起聯(lián)結(jié)作用的輔助酶反應(yīng)。如測定肌激酶活力：其中PEP、Pyr和L分別代表磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和乳酸；AMP、ADP和ATP分別為腺苷一、二和三磷酸。例3：被測反應(yīng)和其它有光學(xué)性質(zhì)改變的酶反應(yīng)偶聯(lián)，如腺苷酸脫氨酶催化AMP脫氨過程中伴隨有265nm光吸收的降低，此酶專一作用于AMP，不作用ADP和ATP。因此在測定某些合成酶或激酶反應(yīng)時，它可用作偶聯(lián)指示酶，肌激酶的測定也可利用它：用這兩種酶組成偶聯(lián)測定系統(tǒng)時，由于它們的最適pH相距較遠(yuǎn)，因而不能在同一系統(tǒng)中進行作用，為此必須分開建立兩個反應(yīng)系統(tǒng)，并在不同時間間隔從肌激酶反應(yīng)系統(tǒng)取樣，然后轉(zhuǎn)入脫氨酶反應(yīng)系統(tǒng)，最后測定。

2．應(yīng)用酶偶聯(lián)測活力應(yīng)注意的事項首先，加入的偶聯(lián)工具酶應(yīng)當(dāng)高度純凈，尤其不能混有待測酶，也不能混有干擾測定的其它酶。其次，偶聯(lián)酶的用量必須過量，以保證被測酶的反應(yīng)速度是總反應(yīng)系統(tǒng)的限制因子，使測得的反應(yīng)速度和被測酶濃度呈線性關(guān)系。第三節(jié)酶法分析應(yīng)用酶作為分析工具的酶分析法可以對酶的底物、輔酶、活化劑或抑制劑進行定量分析。常用的方法有動力學(xué)分析法、終點測定法和-酶標(biāo)免疫測定法。終點測定法應(yīng)用最為普遍。終點測定法是借助某種酶作用，使被測物質(zhì)定量地進行轉(zhuǎn)變，然后在轉(zhuǎn)化完成后，測定底物、產(chǎn)物或輔酶物質(zhì)等的變化量。分為單酶反應(yīng)定量法和偶聯(lián)酶反應(yīng)定量法。3.1單酶反應(yīng)定量法3.2偶聯(lián)酶反應(yīng)定量法終點測定法條件

3.1單酶反應(yīng)定量法單酶反應(yīng)只需要一種催化酶，如下式所示用這種反應(yīng)作底物定量時，可以測定底物的減少量，也可以測定產(chǎn)物的增加量。對含有輔酶的酶，測定輔酶的變化量也是有效的方法。3.1.1底物減少量的測定在待測物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果底物能接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(當(dāng)有99％轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物時，則認(rèn)為反應(yīng)完全)，而且底物又具有某種特征性質(zhì)(如具有特殊的吸收光譜)時，就有可能直接測定底物的減少量而定量待測物。據(jù)此原理能進行測量的物質(zhì)有胞嘧啶(胞嘧啶脫氨酶反應(yīng)280nm處吸光度的減少)，腺嘌呤(腺嘌呤脫氨酶反應(yīng)，280nm處吸光度的減少)以及尿酸等。例：尿酸的定量測定尿酸在293nm、297nm處具有特征吸收峰，其摩爾吸光系數(shù)分別為有明顯差別。利用這一性質(zhì)，通過尿酸酶反應(yīng)，根據(jù)它的吸光度的減少就可算出尿酸量。3.1.2產(chǎn)物增加量的測定在被測物作為底物的酶促反應(yīng)中，如果底物基本上都能轉(zhuǎn)變成為產(chǎn)物，而產(chǎn)物又具有可專一性進行定量測定的物質(zhì)，那么，根據(jù)產(chǎn)物的增加量就能檢測底物的量。如：各種氨基酸類(L-Lys、L-Arg、L-Tyr、L