第七章-微生物的遺傳與變異

上章教學(xué)回顧第六章微生物的生長(zhǎng)及其控制§6-1測(cè)定生長(zhǎng)繁殖的方法§6-2微生物的生長(zhǎng)規(guī)律§6-3影響微生物生長(zhǎng)的主要因素§6-4微生物培養(yǎng)法概論§6-5有害微生物的控制一、測(cè)生長(zhǎng)量二、計(jì)繁殖數(shù)一、溫度二、氧氣三、pH一、微生物的個(gè)體生長(zhǎng)和同步生長(zhǎng)二、單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線(xiàn)三、微生物的連續(xù)培養(yǎng)四、微生物的高密度培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法二、生產(chǎn)實(shí)踐中培養(yǎng)微生物的裝置一、幾個(gè)基本概念二、物理滅菌和消毒的代表——高溫三、化學(xué)殺菌劑、消毒劑和治療劑第七章微生物的遺傳與變異教學(xué)目的與要求了解微生物的遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)，掌握原核微生物與真核微生物的基因重組和突變，熟悉基因工程的基本操作和菌種保藏原理二、

教學(xué)內(nèi)容：1、遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)（☆）2、基因突變和誘變育種（★）3、基因重組和雜交育種（★）4、基因工程5、菌種的衰退、復(fù)壯和保藏遺傳(heredity,inheritance)是指上一代生物將自身的一整套遺傳基因穩(wěn)定地傳遞給下一代的行為或功能，具有極其穩(wěn)定(保守)的特性。遺傳型(genotype)又稱(chēng)基因型，指某一生物個(gè)體所含有的全部遺傳因子即基因組(genome)所攜帶的遺傳信息。遺傳和變異的幾個(gè)基本概念遺傳型(可能性)+環(huán)境條件表型(實(shí)現(xiàn)性)代謝、發(fā)育表型(phenotype)是指某一生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和，是其遺傳型在合適環(huán)境條件下通過(guò)代謝和發(fā)育而得到的具體體現(xiàn)，是一種具體性狀。變異(variation)指生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，亦即遺傳型的改變。特點(diǎn)：在群體中只以極低的幾率(一般10-5~10-10)出現(xiàn)；性狀變化幅度大；變化后的新性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的和不可恢復(fù)的。飾變(modification)指外表修飾性改變，是一種不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。特點(diǎn)：是整個(gè)群體中的幾乎每一個(gè)體都發(fā)生同樣變化；性狀變化的幅度??；因其遺傳物質(zhì)未變，故飾變是不遺傳的和可恢復(fù)的。

如Serratiamarcescens(粘質(zhì)沙雷氏菌，舊稱(chēng)“神靈色桿菌”)。遺傳和變異的幾個(gè)基本概念微生物因其獨(dú)特的生物學(xué)特性而成為模式生物物種與代謝類(lèi)型的多樣性個(gè)體的體制極其簡(jiǎn)單營(yíng)養(yǎng)體一般都是單倍體易于在成分簡(jiǎn)單的組合培養(yǎng)基上大量生長(zhǎng)繁殖繁殖速度快易于積累不同的中間代謝物或終產(chǎn)物菌落形態(tài)的可見(jiàn)性與多樣性環(huán)境條件對(duì)微生物群體中各個(gè)體作用的直接性和均一性易于形成營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株各種微生物一般都有其相應(yīng)的病毒存在多種處于進(jìn)化過(guò)程中、富有特色的原始有性生殖方式遺傳和變異的幾個(gè)基本概念第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)種質(zhì)連續(xù)理論：1883~1889年間德國(guó)A.Weissmann提出。認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物（種質(zhì)）?；?qū)W說(shuō)：1933年摩爾根（ThomasHuntMorgan）發(fā)現(xiàn)了染色體，并證明基因在染色體上呈直線(xiàn)排列，提出了基因?qū)W說(shuō)，使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上。但染色體是由核酸和蛋白質(zhì)兩種長(zhǎng)鏈高分子組成。當(dāng)時(shí)認(rèn)為決定生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是蛋白質(zhì)。DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明：1944年以后，先后有利用微生物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行的3個(gè)著名實(shí)驗(yàn)的論證才使人們普遍接受核酸尤其是DNA才是真正的遺傳物質(zhì)。第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、3個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)一)經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)最早：1928年英國(guó)的F.Griffith，以S.pneumoniae(肺炎鏈球菌)作研究對(duì)象。肺炎鏈球菌SⅢ型：RⅡ型：具莢膜，菌落表面光滑，為致病株不形成莢膜，菌落外觀粗糙，非致病株結(jié)論：加熱殺死的SⅢ型細(xì)菌，在其細(xì)胞內(nèi)可能存在一種具有遺傳轉(zhuǎn)化能力的物質(zhì)，它能通過(guò)某種方式進(jìn)入RⅡ型細(xì)胞，并使RⅡ型細(xì)菌獲得表達(dá)SⅢ型莢膜性狀的遺傳特性。1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty從熱死SⅢ型S.pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，并在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：（1）動(dòng)物試驗(yàn)（3）S型菌的無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)熱死SIII菌—————不生長(zhǎng)

活RII

菌—————長(zhǎng)出RII菌

熱死SIII菌+活RII菌—————長(zhǎng)出大量RII菌和10-6SIII菌活RII菌+SIII菌無(wú)細(xì)胞抽提液——長(zhǎng)出大量RII菌和少量SIII菌平皿培養(yǎng)平皿培養(yǎng)平皿培養(yǎng)（2）細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)示意對(duì)照P190動(dòng)物試驗(yàn)混合培養(yǎng)RII型活菌SIII型活菌SIII型熱死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康健康健康病死病死病死活RⅡ菌長(zhǎng)出SⅢ菌只有RⅡ菌離體轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：1）從活的S菌中抽提各種細(xì)胞成分２)對(duì)各種生化組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)只有SⅢ型細(xì)菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為SⅢ型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。有力地說(shuō)明SⅢ型菌株轉(zhuǎn)移給RⅡ型菌株的決不是遺傳性狀（有無(wú)莢膜）本身，而是DNA遺傳因子。①加SⅢ菌DNA②加SⅢ菌DNA及DNA酶以外的酶③加SⅢ菌的DNA和DNA酶④加SⅢ菌的RNA⑤加SⅢ菌的蛋白質(zhì)⑥加SⅢ菌的莢膜多糖二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn)A.D.Hershey和M.Chase，1952年進(jìn)行首先把E.coli培養(yǎng)在以放射性32PO43-或35SO42-作為磷源或硫源的組合培養(yǎng)基中，從而制備出含32P-DNA或含35S-蛋白質(zhì)的噬菌體接著，進(jìn)行了兩組實(shí)驗(yàn)（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性沉淀中含25%放射性（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含75%放射性二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在噬菌體感染過(guò)程中，其蛋白質(zhì)外殼根本未進(jìn)入宿主細(xì)胞。進(jìn)入宿主細(xì)胞雖只有DNA，但卻有自身的增殖、裝配能力，最終會(huì)產(chǎn)生一大群完整子代噬菌體。結(jié)論：證實(shí)DNA是噬菌體的遺傳物質(zhì)，在DNA中，存在著包括合成蛋白質(zhì)外殼在內(nèi)的整套遺傳信息。三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn)。方法：將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質(zhì)外殼與RNA核心相分離。分離后的RNA在沒(méi)有蛋白質(zhì)包裹的情況下，也能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑中還能分離出完整的TMV粒子。選用了HRV（霍氏車(chē)前花葉病毒）與TMV進(jìn)行了如下拆分與重建實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)方法A：RNA（TMV）-蛋白質(zhì)（HRV）B：RNA（HRV）-蛋白質(zhì)（TMV）用兩種雜合病毒感染煙草：A:表現(xiàn)TMV的典型癥狀并分離到正常TMV粒子B:表現(xiàn)HRV的典型癥狀并分離到正常HRV粒子。結(jié)論：在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸(RNA)TMVHRVHRVTMV拆分重建核酸的特性及復(fù)制方式(補(bǔ)充)1、核酸的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)2、核酸的特性溫度升高導(dǎo)致雙鏈的解鏈（變性），當(dāng)溫度緩慢降低時(shí)被解鏈的DNA能夠重新配對(duì)（復(fù)性），不同來(lái)源的DNA之間堿基序列互補(bǔ)的區(qū)段也能夠進(jìn)行堿基配對(duì)（退火或雜交）。二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式核酸存在的七個(gè)水平細(xì)胞水平：大部分DNA都集中在細(xì)胞核或核區(qū)中，數(shù)目1-2個(gè)。細(xì)胞核水平：核染色體組（核基因組或基因組）和核外染色體。染色體水平：染色體數(shù)和染色體倍數(shù)（單倍、雙倍）核酸水平：核酸種類(lèi)、核酸結(jié)構(gòu)、DNA長(zhǎng)度基因水平：具有特定核苷酸序列的核酸片段（遺傳功能單位）密碼子水平（遺傳信息單位）遺傳密碼是指DNA鏈上決定各具體氨基酸的特定核苷酸順序。其信息單位是密碼子。每一密碼子由3個(gè)核苷酸序列即1個(gè)三聯(lián)體組成。核苷酸水平（核苷酸單位或堿基單位）最低突變單位或交換單位第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)掌握幾個(gè)有用的數(shù)據(jù)：①每個(gè)堿基對(duì)（pb）的平均相對(duì)分子質(zhì)量約為650；②1×106的dsDNA約為1.5kb或0.5μm;③3nmol堿基的重量約等于1μg。④多數(shù)細(xì)菌的基因組為1～9Mb第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式1、細(xì)胞核水平1）在原核細(xì)胞中染色體DNA(核染色體)：在核區(qū)內(nèi)，雙鏈，環(huán)狀或線(xiàn)狀，無(wú)組蛋白；染色體外DNA(核外染色體):質(zhì)粒(F質(zhì)粒、R質(zhì)粒、Col質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、mega質(zhì)粒和降解質(zhì)粒)2）在真核細(xì)胞中核DNA：在細(xì)胞核內(nèi)與組蛋白結(jié)合成核小體；核外DNA：細(xì)胞質(zhì)基因(包括線(xiàn)粒體和葉綠體基因等)；共生生物（如卡巴顆粒）；2μm質(zhì)粒(釀酒酵母的在核內(nèi))等。原核生物的質(zhì)粒1、定義典型質(zhì)粒：凡游離于原核生物核基因組以外，具有獨(dú)立復(fù)制能力的小型共價(jià)閉合環(huán)狀的dsDNA(cccDNA)分子。線(xiàn)形質(zhì)粒2、特點(diǎn)具有麻花狀的超螺旋結(jié)構(gòu)，大小一般為1.5~300kb。攜帶某些核基因組上所缺少的基因，使細(xì)菌等原核生物獲得了某些對(duì)其生存并非必不可少的特殊功能。復(fù)制類(lèi)型有嚴(yán)緊型復(fù)制控制和松弛型復(fù)制控制兩種。含質(zhì)粒的細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基上受吖啶類(lèi)染料、絲裂霉素C、紫外線(xiàn)、利福平等因子處理后，會(huì)發(fā)生質(zhì)粒消除。具有與核基因組整合與脫離功能，這類(lèi)質(zhì)粒又稱(chēng)為附加體。質(zhì)粒與質(zhì)粒間，質(zhì)粒與核染色體間發(fā)生基因重組。原核生物的質(zhì)粒3、質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)①體積小，便于DNA的分離和操作；②呈環(huán)狀，使其化學(xué)分離過(guò)程中能保持性能穩(wěn)定；③有不受核基因組控制的獨(dú)立復(fù)制起始點(diǎn)；④拷貝數(shù)多，使外源DNA可很快擴(kuò)增；⑤存在抗藥性基因等選擇性標(biāo)記，便于含質(zhì)?？寺〉臋z出和選擇（如E.coli的pBR322質(zhì)粒）4、質(zhì)粒的分離與鑒定分離：細(xì)胞的裂解、蛋白質(zhì)和RNA去除以及質(zhì)粒DNA與染色體DNA分離。鑒定：電鏡、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳及密度梯度離心法。第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、基因水平：

是生物體內(nèi)一切具有自主復(fù)制能力的最小遺傳功能單位，其物質(zhì)基礎(chǔ)是一條以直線(xiàn)排列、具有特定核苷酸序列的核酸片斷。由眾多的基因構(gòu)成了染色體。以原核生物為例：基因調(diào)控系統(tǒng)操縱子啟動(dòng)基因(啟動(dòng)子)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因DNA鏈RAmRNABmRNACmRNAOabc蛋白質(zhì)第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、基因水平：真核生物的基因與原核生物的基因最明顯的不同是它們一般無(wú)操縱子結(jié)構(gòu)，存在著大量不編碼序列和重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯在細(xì)胞中有空間分隔，以及基因被許多無(wú)編碼功能的內(nèi)含子阻隔，從而使編碼序列變成不連續(xù)的外顯子狀態(tài)。第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變簡(jiǎn)稱(chēng)“突變”。是變異的一類(lèi)，泛指細(xì)胞(病毒粒)內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。狹義的突變專(zhuān)指基因突變(點(diǎn)突變)；廣義的突變則包括基因突變和染色體畸變。野生型菌株：簡(jiǎn)稱(chēng)野生型，指從自然界分離到的菌株。突變株(變異體、變異型)野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株。（一）突變類(lèi)型突變株的表型選擇性突變株非選擇性突變株?duì)I養(yǎng)缺陷型(株)抗性突變型(株)條件致死突變型(株)形態(tài)突變型(株)抗原突變型(株)產(chǎn)量突變型(株)★依表型的改變分為：營(yíng)養(yǎng)缺陷型——因突變而喪失合成一種或幾種生長(zhǎng)因子、堿基或氨基酸等生物合成酶的能力，因而無(wú)法再在基本培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)繁殖，而必須在基本培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變類(lèi)型?？剐酝蛔冃汀蛲蛔兌a(chǎn)生了對(duì)某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性，它們可在加有相應(yīng)藥物或用相應(yīng)物理因子處理的平板上選出條件致死突變型——突變后在某種條件下可正常生長(zhǎng)繁殖，并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一條件下卻無(wú)法生長(zhǎng)繁殖的突變型形態(tài)突變型——由突變引起的個(gè)體或菌落形態(tài)的變異抗原突變型——因突變而引起的細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)量突變型——因突變而要代謝物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株。（一）突變類(lèi)型每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。也可用某一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株的數(shù)目來(lái)表示。突變率=突變細(xì)胞數(shù)/分裂前群體細(xì)胞數(shù)突變是獨(dú)立的。某一基因發(fā)生突變不會(huì)影響其它基因的突變率。因此，在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)基因突變的幾率是極低的，因?yàn)殡p重突變型的幾率只是各個(gè)突變幾率的乘積。由于突變的幾率一般都極低，因此，必須采用檢出選擇性突變株的手段，尤其是采用檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株（backmutant或reversemutant）或抗性突變株特別是抗藥性突變株的方法來(lái)加以確定。（二）突變率（二）突變率基因符號(hào)基因的名稱(chēng)用其英文單詞的頭3個(gè)小寫(xiě)英文字母表示，且應(yīng)排成斜體字（書(shū)寫(xiě)時(shí)可在其下劃一底線(xiàn)區(qū)別）。同一基因的不同基因突變則在3個(gè)英文小寫(xiě)字母后加一個(gè)正體大寫(xiě)字母或數(shù)字表示。如hisA、hisB代表組氨酸的A、B基因。在基因名稱(chēng)右上方可用不同符號(hào)表示微生物的突變型:his+、his-分別表示組氨酸原養(yǎng)型和缺陷型，gal+、gal-分別表示能發(fā)酵半乳糖和不能發(fā)酵半乳糖

strS、strR分別表示對(duì)鏈霉素敏感和具有抗性蛋白質(zhì)（基因表達(dá)產(chǎn)物）的符號(hào)用其英文單詞的頭3個(gè)大寫(xiě)英文字母（或1個(gè)大寫(xiě)，2個(gè)小寫(xiě)）表示，且應(yīng)排成正體字（三）突變的特點(diǎn)1.自發(fā)性:2.稀有性:3.可誘變性:4.不對(duì)應(yīng)性：5.獨(dú)立性：6.穩(wěn)定性：7.可逆性：自發(fā)突變率極低而且穩(wěn)定，10-6～10-9各種性狀的突變自發(fā)地發(fā)生在誘變劑作用下，自發(fā)突變可提高10-10000倍突變的性狀與引起突變的原因之間無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如，在紫外線(xiàn)作用下，除產(chǎn)生抗紫外線(xiàn)的突變體外．還可誘發(fā)任何其他性狀的變異某一基因的突變率不受它種基因突變率的影響。說(shuō)明突變對(duì)某一細(xì)胞或某一基因都是隨機(jī)的。突變的根源是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生了穩(wěn)定變化，故產(chǎn)生的新的變異性狀也是穩(wěn)定的、可遺傳的。任何性狀都可發(fā)生正向突變，也都可以發(fā)生相反的過(guò)程——回復(fù)突變。（四）基因突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明在各種基因突變中，抗性突變最為常見(jiàn)。但在過(guò)去相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)這種抗性產(chǎn)生的原因爭(zhēng)論十分激烈。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，突變是通過(guò)適應(yīng)而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的抵抗對(duì)象）誘發(fā)出來(lái)的，突變的原因和突變的性狀間是相對(duì)應(yīng)的，并認(rèn)為這就是“定向變異”，也有人稱(chēng)它為“馴化”或“馴養(yǎng)”。另一種看法則認(rèn)為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對(duì)應(yīng)的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯(cuò)綜在一起，所以難以探究問(wèn)題的實(shí)質(zhì)。從1943年起，經(jīng)過(guò)幾個(gè)嚴(yán)密而巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要攻克了如何檢出在接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題，終于在科學(xué)的基礎(chǔ)上結(jié)束了這場(chǎng)紛爭(zhēng)。（五）基因突變及其機(jī)制誘變(誘發(fā)突變)自發(fā)突變點(diǎn)突變(基因突變)畸變堿基置換移碼突變基因突變轉(zhuǎn)換：顛換A←→G，T←→CA←→T，A←→CG←→C，G←→T缺失：插入：缺失：添加易位(轉(zhuǎn)座)：倒位：重復(fù)：插入：染色體DNA序列從某一部位轉(zhuǎn)移到同一染色體上另一部位或其他染色體上某一部位的現(xiàn)象。

染色體發(fā)生兩次斷裂后，某一區(qū)段發(fā)生顛倒，而后又愈合的現(xiàn)象。一)自發(fā)突變概念：指生物體自然發(fā)生而非人為引起的突變1、基因突變的自發(fā)性和不對(duì)稱(chēng)性的實(shí)驗(yàn)證明變量試驗(yàn)：1943年S.E.Luria和M.Delbruck涂布試驗(yàn):1949年H.B.Newcombe影印平板培養(yǎng)試驗(yàn)：1952年J.Lederberg夫婦2、自發(fā)突變的原因(機(jī)制)由背景輻射或環(huán)境因素引起誘變作用，如宇宙射線(xiàn)、加熱等微生物自身產(chǎn)生誘變物質(zhì)如微生物細(xì)胞內(nèi)的咖啡堿、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氖絲氨酸及過(guò)氧化氫等。DNA復(fù)制中．偶然堿基配對(duì)錯(cuò)誤(10-7~10-11×1000=10-6)

，引起突變。大腸桿菌稀釋培養(yǎng)物(103/mL)10ml10ml(培養(yǎng)前先分成50小管)(在同一大管中作整體培養(yǎng)后分50份)(抗噬菌體菌落數(shù))(抗噬菌體菌落數(shù))3,2,64,1,0103,1,21,7,17,4,5,4,7,5,3,6,4,5Luria等的變量實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

①E.Coli抗噬菌體性狀的產(chǎn)生，并非由所抗的環(huán)境因素（即噬菌體T1）誘導(dǎo)出來(lái)的，而是在它接觸T1前，在某次細(xì)胞分裂過(guò)程中自發(fā)產(chǎn)生的。這一自發(fā)突變發(fā)生得越早，抗性菌落出現(xiàn)得就越多，反之則越少。②噬菌體T1在這里僅起淘汰原始的未突變菌株和甄別抗噬菌體突變型的作用，而決非“馴養(yǎng)者”。保溫5h保溫5h噴入T1保溫噴入T1保溫6個(gè)平板重新涂布噴入T1保溫噴入T1保溫6個(gè)平板重新涂布I個(gè)小菌落生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生抗噬菌體突變?cè)谖磭娛删wT1前沒(méi)有突變細(xì)胞自發(fā)突變假說(shuō)獲得免疫性假說(shuō)在12個(gè)瓊脂平板上每個(gè)平板涂布5*104個(gè)大腸桿菌的噬菌體敏感性細(xì)胞每個(gè)平板上有5*104個(gè)小菌落，每個(gè)菌落約含5000個(gè)細(xì)菌1個(gè)抗噬菌體菌落（共28個(gè)）小菌落中每個(gè)抗噬菌體細(xì)胞產(chǎn)生1個(gè)抗菌體菌落（共353個(gè)）兩組平板有相同數(shù)目的細(xì)菌，所以將產(chǎn)生相同數(shù)目的抗噬菌體菌落N(xiāo)ewcombe的涂布試驗(yàn)結(jié)論：

①E.Coli抗噬菌體突變的確發(fā)生在與T1接觸之前。②噬菌體T1的加入只起到甄別這類(lèi)自發(fā)突變是否發(fā)生作用，而不是誘發(fā)相應(yīng)突變的原因。涂布試驗(yàn)中突變率的計(jì)算初始接種量：5×104個(gè)/皿培養(yǎng)5小時(shí)，繁殖了12.3代，每個(gè)微菌落約含5100個(gè)細(xì)菌這時(shí)，每個(gè)平皿上的細(xì)胞數(shù)為：5100×5×104≈2.6×108個(gè)/皿在6個(gè)平板上，比接種時(shí)增加的細(xì)胞數(shù)為：

6×（2.6×108

5×104）=15.6×108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個(gè)突變，故突變率=28/15.6×108=1.8×108含藥物的培養(yǎng)皿不含藥物的培養(yǎng)皿原始敏感菌種123456789111210影印接種Lederberg等設(shè)計(jì)的平板影印培養(yǎng)法二)誘發(fā)突變誘發(fā)突變：簡(jiǎn)稱(chēng)誘變。指通過(guò)人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。誘變劑：凡具有誘變效應(yīng)的任何因素?；瘜W(xué)因素的誘變物理因素的誘變紫外線(xiàn)X射線(xiàn)和γ射線(xiàn)等是不帶電的光量子，不能直接引起物質(zhì)原子電離或激發(fā)，但在與基因分子碰撞時(shí)，把全部或部分能量傳給原子而產(chǎn)生次級(jí)電子。這些次級(jí)電子一般具有很高的能量，能產(chǎn)生電離作用；因而直接或間接地改變DNA結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)因素的誘變1、直接引起堿基置換的誘變劑是一類(lèi)可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)誘變劑，能與所有生物體的DNA，無(wú)論它是離體的DNA、離菌的噬菌體還是代謝作用幾乎停頓的細(xì)胞(如芽孢)等都發(fā)生化學(xué)作用，從而引起突變(主要轉(zhuǎn)換，極少顛換)。如亞硝酸、烷化劑、羥胺。2、間接引起堿基置換的誘變劑是一些堿基類(lèi)似物，其結(jié)構(gòu)與DNA中的堿基十分相似，但穩(wěn)定性較正常堿基小，在菌體內(nèi)能以不同的形式存在(如5—溴尿嘧啶能以酮式或烯醇式狀態(tài)存在)它們能通過(guò)活細(xì)胞的代謝作用摻入到DNA分子中而不妨礙DNA的正常復(fù)制，但其發(fā)生的錯(cuò)誤配對(duì)可引起堿基的置換?；瘜W(xué)因素的誘變3、移碼誘變劑能插入DNA分子的堿基對(duì)之間，使DNA鏈結(jié)構(gòu)變形，并在DNA復(fù)制時(shí)由于不對(duì)稱(chēng)交換，引起DNA鏈中插入或缺失一個(gè)或幾個(gè)堿基，造成這一對(duì)核苷酸后的整個(gè)密碼的移動(dòng)，產(chǎn)生移碼突變。物理因素的誘變紫外線(xiàn)(UV)對(duì)DNA的損傷與修復(fù)損傷DNA具有強(qiáng)烈的紫外吸收能力，尤其是核酸鏈上的堿基對(duì)，其中嘧啶比嘌呤更敏感。紫外線(xiàn)的大劑量作用可導(dǎo)致菌體死亡，小劑量則可引起突變。生物學(xué)效應(yīng)：DNA鏈斷裂、DNA分子內(nèi)部和分子間交聯(lián)、核酸和蛋白質(zhì)交聯(lián)、嘧啶堿的水合作用及胸腺嘧啶二聚體的形成等。同一條鏈上：雙鏈解開(kāi)和復(fù)制受阻，導(dǎo)致死亡兩條鏈上：破壞腺嘌呤的正常摻入和堿基配對(duì)，導(dǎo)致突變物理因素的誘變紫外線(xiàn)(UV)對(duì)DNA的損傷與修復(fù)修復(fù)光復(fù)活：把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見(jiàn)光下時(shí)，就可出現(xiàn)明顯降低其死亡率的現(xiàn)象。經(jīng)UV照射后形成了胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗中會(huì)被一種光激活酶(光解酶、光裂酶)結(jié)合而穩(wěn)定存在，但在300-500nm可見(jiàn)光下，此酶會(huì)因獲得光能而激活，并使二聚體重新分解成單體。注意：在利用UV進(jìn)行誘變育種時(shí)，就應(yīng)在紅光進(jìn)行照射和后續(xù)操作，并放置在黑暗條件下培養(yǎng)。暗復(fù)活(暗修復(fù)、切除修復(fù))是活細(xì)胞一種用于對(duì)被UV等誘變劑損傷后不依賴(lài)可見(jiàn)光，只通過(guò)酶切作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸修復(fù)方式。二、突變與育種一)自發(fā)突變與育種１、從生產(chǎn)中育種如從污染噬菌體的發(fā)酵液中，分離到抗噬菌體突變株；酒精工廠糖化酶產(chǎn)生菌中，篩選到糖化力強(qiáng)、培養(yǎng)條件較粗放的白色孢子變種“上酒白種”等。２、定向培育優(yōu)良菌株定向培育：利用微生物的自發(fā)突變，采用特定的選擇條件，通過(guò)對(duì)微生物群體不斷移植以選育出較優(yōu)良菌株的過(guò)程。19世紀(jì)，巴斯德培育低毒力的炭疽芽孢桿菌活菌苗；牛型結(jié)核桿菌接種在含牛膽汁和甘油的馬鈴薯培養(yǎng)基上篩選卡介苗。二、突變與育種二)誘變育種概念：利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，把適合人類(lèi)需要的少數(shù)優(yōu)良菌株選育出來(lái)的過(guò)程。實(shí)踐意義可獲得供工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的各種菌株。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門(mén)所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無(wú)例外地都是通過(guò)誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。如青霉素生產(chǎn)菌株(產(chǎn)黃青霉)的選育二)誘變育種1、基本環(huán)節(jié)出發(fā)菌株誘變絕大多數(shù)個(gè)體死亡少數(shù)存活多數(shù)未變少數(shù)突變多數(shù)負(fù)變少數(shù)正變多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大多數(shù)不投產(chǎn)少數(shù)宜投產(chǎn)可計(jì)算：存活率突變率正變率“高產(chǎn)率”投產(chǎn)率二)誘變育種2、一般原則(1)選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑。(2)挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株

(3)處理成單細(xì)胞或單孢子懸液(4)選用最適劑量(5)充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)(6)利用和創(chuàng)造微生物形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)，以便在初篩中即可從形態(tài)性狀估計(jì)其生產(chǎn)潛力。(7)設(shè)計(jì)和采用高效篩選方案和方法(初篩和復(fù)篩)(8)創(chuàng)造新型篩選方法１）選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑誘變劑的種類(lèi)：物理誘變劑和化學(xué)誘變劑誘變劑的選擇在同樣效果下，應(yīng)選用最簡(jiǎn)便的因素；在同樣簡(jiǎn)便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。簡(jiǎn)便有效的誘變方法：紫外線(xiàn)的照射最為簡(jiǎn)便。設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、無(wú)可見(jiàn)光（只有紅光）暗室等，紫外燈：波長(zhǎng)為253.7nm,

功率是15W，處理時(shí)的照射距離：20cm～30cm，照射時(shí)間不短于10～20s,也不長(zhǎng)于10～20min。樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過(guò)3mm(常可取5mL單細(xì)胞懸液放置在直徑為6cm的小培養(yǎng)皿中，在無(wú)蓋的條件下直接照射)。照射時(shí)，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時(shí)間或死亡率作為相對(duì)劑量。１）選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑簡(jiǎn)便有效的誘變方法化學(xué)誘變劑的種類(lèi)、濃度和處理方法尤其是中止反應(yīng)的方法很多，實(shí)際工作時(shí)可參看有關(guān)書(shū)籍。一種較有效的簡(jiǎn)易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞，然后在平板上劃區(qū)并分別均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)保溫培養(yǎng)后，可發(fā)現(xiàn)在顆粒周?chē)幸煌该鞯囊志?，在抑菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，將它們一一制成懸浮液，再分別涂布在瓊脂平板表面，使長(zhǎng)出許多單菌落，最后可用影印平板法或逐個(gè)檢出法選出突變種。2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株

出發(fā)菌株———用來(lái)育種處理的起始菌株

◆出發(fā)菌株應(yīng)具備：

①對(duì)誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；

◆出發(fā)菌株的來(lái)源；

①自然界直接分離到的野生型菌株

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的自發(fā)突變菌株

③具有有利于進(jìn)一步研究或應(yīng)用性關(guān)的菌株

④已經(jīng)歷多次育種處理的菌株３)處理單細(xì)胞或單孢子懸液

指某一突變?cè)贒NA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在表型上顯示出來(lái)，造成不純的菌落。產(chǎn)生原因：①分離性遲延現(xiàn)象②生理性遲延現(xiàn)象要求：

①菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)；

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞或單孢子懸液，以避免表型遲延現(xiàn)象方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加0.3%吐溫80（表面活性劑）

③用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾。

制備：

物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液濃度：

細(xì)菌、放線(xiàn)菌108個(gè)/mL

霉菌、酵母菌106個(gè)/mL４)選用最適的誘變劑量劑量的表示法：不同種類(lèi)和不同生長(zhǎng)階段的微生物對(duì)誘變劑的敏感程度不同，致死率是最好的誘變劑相對(duì)劑量的表示方法。最適劑量的選擇：某誘變劑的劑量～存活率～誘變率三者的最佳結(jié)合點(diǎn)。劑量存活率曲線(xiàn)：劑量誘變率曲線(xiàn)：實(shí)際工作中：產(chǎn)量性狀的正變較多傾向于低劑量（如，在UV作誘變劑中，控制致死率在70-75%甚至30-70％）第一輪：一個(gè)出發(fā)菌株→→→選出200個(gè)菌株→→→選出50株→→→選出5株誘變處理初篩（每瓶一株）復(fù)篩（每瓶四株）第二輪：5個(gè)出發(fā)菌株→→→→→→選出50株→→→選出5株40株40株40株40株40株誘變初篩復(fù)篩（每瓶一株）（每瓶四株）第三輪，第四輪……(都同第二輪)創(chuàng)造新型篩選方法初篩：以粗測(cè)為主。平板或搖瓶平皿快速檢測(cè)法變色圈法水解圈法、顯色圈法生長(zhǎng)圈法：營(yíng)養(yǎng)缺陷株的篩選抑菌圈法：產(chǎn)量突變株的篩選梯度平板法：抗性突變株的篩選搖瓶培養(yǎng)法復(fù)篩：用搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐精測(cè)３、3類(lèi)突變株的篩選方法產(chǎn)量突變株的篩選抗藥性突變株的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選產(chǎn)量突變型的篩選操作要點(diǎn)：１）把誘變后的微生物的單細(xì)胞懸液均勻涂布在瓊脂平板上；２）待長(zhǎng)上稀疏的小菌落后，用打孔器一一取出長(zhǎng)有單菌落的瓊脂小塊；３）分別把它們整齊地移入滅菌的空培養(yǎng)皿內(nèi)，在合適的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-5d；4）把每一長(zhǎng)滿(mǎn)單菌落的瓊脂再轉(zhuǎn)移至已混有供試菌的大塊瓊脂平板上，以分別測(cè)定各小塊的抑菌圈，擇優(yōu)取之。方法：梯度平板法（gradientplate）抗藥性突變株的篩選抗藥性突變株的應(yīng)用：作為菌株的遺傳標(biāo)記作為生產(chǎn)菌種（結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性變異株）圖7-18用梯度平板法定向篩選抗性突變株1)與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的3類(lèi)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(MM，符號(hào)為[-])——能滿(mǎn)足某一種的野生型或原養(yǎng)型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM,符號(hào)為[A]或[B])——在基本培養(yǎng)基中有針對(duì)性地補(bǔ)加某一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分，以滿(mǎn)足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)需要(其他營(yíng)養(yǎng)缺陷型仍不能生長(zhǎng))的培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基(CM,符號(hào)為[+])——可滿(mǎn)足該菌各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選2)與營(yíng)養(yǎng)缺陷型有關(guān)的3類(lèi)遺傳型個(gè)體野生型——變異前的原始菌株。能在相應(yīng)的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。若A、B兩個(gè)基因表示其對(duì)這兩種營(yíng)養(yǎng)物合成能力，則野生型株的遺傳型應(yīng)是[A+B+]。營(yíng)養(yǎng)缺陷型——原菌株由于發(fā)生基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，喪失了合成某種代謝產(chǎn)物的能力，因而無(wú)法再在基本培養(yǎng)基(MM)上正常生長(zhǎng)繁殖，必須在培養(yǎng)基中外源補(bǔ)加該物質(zhì)(補(bǔ)充培養(yǎng)基)才能生長(zhǎng)的菌株。A營(yíng)養(yǎng)缺陷型的遺傳型用[A-B+]表示原養(yǎng)型——營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營(yíng)養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。遺傳型也為[A+B+]。誘變回變或重組艾姆氏試驗(yàn)基本原理：

S.t.（鼠傷寒沙門(mén)氏菌）的his-菌株在基本培養(yǎng)基[-]平板上不能生長(zhǎng)，而其回復(fù)突變成his+菌株后則能生長(zhǎng)。利用細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變來(lái)檢測(cè)環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑的簡(jiǎn)便有效方法。許多化學(xué)物質(zhì)原先并非誘變劑或致癌劑，只有在進(jìn)入機(jī)體并在肝臟的解毒過(guò)程中，受到肝細(xì)胞中一些加氧酶的作用，才形成有害物。有某種高濃度誘變劑存在有某種適當(dāng)濃度誘變劑存在①賴(lài)氨酸發(fā)酵菌種：谷氨酸棒桿菌的Hom–②肌苷酸（IMP）發(fā)酵調(diào)控理論的實(shí)踐應(yīng)用菌種：谷氨酸棒桿菌的酶12的腺嘌呤缺陷型★抗反饋調(diào)節(jié)突變株——是指對(duì)反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐裕騼烧呒嬗兄慕M成型菌株。菌種：黃色短桿菌的抗AHV突變株菌種：黃色短桿菌抗AHV菌株的甲硫氨酸缺陷型③蘇氨酸發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選3)篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的一般步驟和萬(wàn)法a、誘變：常用紫外線(xiàn)誘變形成少量營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。b、中間培養(yǎng)：用完全培養(yǎng)基或補(bǔ)充培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜c、淘汰野生型(濃縮缺陷型)抗生素法：某些抗生素能殺死生長(zhǎng)繁殖著的微生物，而對(duì)處于休止?fàn)顟B(tài)的微生物無(wú)殺傷作用。如青霉素(細(xì)菌)；制霉菌素(真菌)菌絲過(guò)濾法：適用于放線(xiàn)菌、霉菌等絲狀微生物。d、檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型逐個(gè)測(cè)定法(點(diǎn)種法)把經(jīng)誘變處理并淘汰野生型后的菌液在完全培養(yǎng)基上涂布分離，將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的每—個(gè)茵落分別點(diǎn)種在基本培養(yǎng)基和另一個(gè)完全培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時(shí)間后，凡在基本培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)而在完全培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上能生長(zhǎng)的菌落，表明其為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選e、鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型——生長(zhǎng)譜法：將檢出的缺陷型菌株接種在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)，把生長(zhǎng)的菌體或孢子經(jīng)離心和無(wú)菌水清洗后制成濃度為107-l08個(gè)/mL的菌懸液。取0.1m1該懸液與基本培養(yǎng)基混勻倒皿，冷凝并稍干燥后，分區(qū)加沾有各種營(yíng)養(yǎng)物的濾紙片，培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)反應(yīng)。

生長(zhǎng)譜法1.單一營(yíng)養(yǎng)缺陷型2.非所涂物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型3-4.雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷型5.回復(fù)突變型6.高濃度生長(zhǎng)因子抑制作用①生長(zhǎng)譜法方法簡(jiǎn)便；回變和污染不影響結(jié)果測(cè)定物質(zhì)可為粉末或紙片

缺陷型的鑒定測(cè)定一般應(yīng)分兩階段：第一階段：測(cè)定是哪類(lèi)物質(zhì)的缺陷型；第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍，進(jìn)一步確定是哪種具體化合物的缺陷型；②組合營(yíng)養(yǎng)物法：步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）：a.將多種營(yíng)養(yǎng)因子編組；b.將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c.結(jié)果分析；如：一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：4811

1314

五組：59121415營(yíng)養(yǎng)因子分組編排時(shí)注意；1）每組內(nèi)無(wú)重復(fù)的營(yíng)養(yǎng)因子2）每組中應(yīng)包含只出現(xiàn)一次的因子3）每組中其他因子應(yīng)分別出現(xiàn)二次

缺陷型的鑒定一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：4811

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五組：59121415③組合補(bǔ)充培養(yǎng)基法：將待測(cè)的菌點(diǎn)種到各種補(bǔ)充培養(yǎng)基上，逐個(gè)分析各菌的缺陷類(lèi)型，或快速分離出所需缺陷類(lèi)型的菌株。ABFEDCHG

缺陷型的鑒定★缺陷型的應(yīng)用作為菌株的遺傳標(biāo)記：進(jìn)行基因工程、誘變育種、研究代謝過(guò)程時(shí)用作親本標(biāo)記；作為生產(chǎn)菌種：aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種;作為aa、維生素、堿基的測(cè)定菌株。第三節(jié)基因重組與雜交育種一、原核微生物的基因重組二、真核微生物的基因重組一、原核生物的基因重組一)轉(zhuǎn)化(transformation)概念受體菌直接吸收供體菌的DNA片斷而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。通過(guò)轉(zhuǎn)化形成的后代，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化子，有轉(zhuǎn)化活性的外來(lái)DNA片斷為轉(zhuǎn)化因子。微生物的種類(lèi)：十分普遍感受態(tài)(competence)指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。轉(zhuǎn)化過(guò)程：S.pneumoniae(G+)轉(zhuǎn)染：指用提純的病毒核酸(DNA或RNA)去感染其宿主細(xì)胞或其原生質(zhì)體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化過(guò)程感受態(tài)細(xì)胞的建立用人工方法提高受體菌的感受態(tài)水平DNA的結(jié)合與攝取首先供體菌的dsDNA與受體菌細(xì)胞表面上的接受位點(diǎn)相結(jié)合，其中一條鏈被細(xì)胞表面上的核酸酶水解，水解產(chǎn)生的能量協(xié)助把另一條鏈推進(jìn)受體細(xì)胞。轉(zhuǎn)化因子與染色體重組來(lái)自供體菌的ssDNA片斷與雙鏈結(jié)構(gòu)受體染色體DNA同源片斷發(fā)生交換重組，形成一小段雜合DNA區(qū)段；然后受體菌染色體進(jìn)行復(fù)制，于是雜合區(qū)也隨之得到復(fù)制，細(xì)胞分裂后，形成一個(gè)轉(zhuǎn)化子(strR)和一仍保持受體菌原來(lái)基因型(strS)的子代。供體(strR)dsDNA感受態(tài)受體(strS)酶解與吸收單鏈同源區(qū)段配對(duì)單鏈整合復(fù)制與分裂轉(zhuǎn)化子(strR)非轉(zhuǎn)化子(strS)轉(zhuǎn)化過(guò)程示意圖一、原核微生物的基因重組二)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)概念通過(guò)缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得部分新性狀的重組細(xì)胞，稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。種類(lèi)1、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)3、溶原轉(zhuǎn)變1、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)概念通過(guò)極少數(shù)完全缺陷噬菌體(噬菌體內(nèi)僅含有供體DNA)對(duì)供體基因上任何小片段DNA進(jìn)行誤包(錯(cuò)誤的裝配)，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象。一般用溫和噬菌體為媒介。分類(lèi)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)：簡(jiǎn)稱(chēng)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)或完全轉(zhuǎn)導(dǎo)。流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)：簡(jiǎn)稱(chēng)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒感染供體細(xì)菌子代病毒含病毒DNA的顆粒含宿主DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒感染感染受體細(xì)胞噬菌體生長(zhǎng)重組產(chǎn)生更多的病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)子由P22噬菌體引起的完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖宿主的DNA2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)概念指通過(guò)部分缺陷(含有部分宿主的DNA)的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。特點(diǎn) ①只局限于傳遞供體菌核染色體上的個(gè)別特定基因，一般為噬菌體整合位點(diǎn)兩側(cè)的基因②該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶③缺陷噬菌體的形成是由于它在脫離宿主核染色體過(guò)程中，發(fā)生低頻率(10-6)誤切(反常切除)④局限轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的產(chǎn)生要通過(guò)UV等因素對(duì)溶源菌的誘導(dǎo)并引起裂解后產(chǎn)生。分類(lèi)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)LFT)通過(guò)一般溶源菌釋放的噬菌體所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)，只形成極少數(shù)(10-4~10-6)轉(zhuǎn)導(dǎo)子。高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)HFT)通過(guò)對(duì)雙重溶源菌的誘導(dǎo)所釋放的噬菌體所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可形成高達(dá)50%左右的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。同時(shí)有兩種噬菌體整合在細(xì)菌的染色體上前噬菌體：沒(méi)有感染力圖1.1-4細(xì)菌受噬菌體感染后的兩種反應(yīng)

A.裂解反應(yīng)B.溶原性反應(yīng)自發(fā)或誘導(dǎo)變異營(yíng)養(yǎng)態(tài)游離態(tài)整合態(tài)一、原核微生物的基因重組三)接合(conjugation,mating)概念：供體菌(“雄性”)通過(guò)性菌毛與受體菌(“雌性”)直接接觸，把F質(zhì)粒或其攜帶的不同長(zhǎng)度的核基因組片斷傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象。接合之后的受體細(xì)胞稱(chēng)接合子。能進(jìn)行接合的微生物：細(xì)菌和放線(xiàn)菌E.coli的雜交實(shí)驗(yàn)E.coli的4種接合型菌株與F因子E.coli的雜交實(shí)驗(yàn)A+B+C-D-A-B-C+D+[+]離心后洗凈A+B+A-B-C-D-C+D+A+B+C+D+2×1081×1081×1082×108無(wú)菌落生長(zhǎng)無(wú)菌落生長(zhǎng)研究細(xì)菌接合的營(yíng)養(yǎng)缺陷型法原理A,B,C,D：met,bio,thr,leu[-][-][-]E.coli的4種接合型菌株與F因子100/0255075轉(zhuǎn)移區(qū)tra復(fù)制區(qū)rep轉(zhuǎn)座因子F因子

即F質(zhì)粒，又稱(chēng)致育因子或性因子，是小分子的DNA，長(zhǎng)約6×104bp，約為E.coli染色體的2%。1、F+菌株即“雄性”菌株，指細(xì)胞內(nèi)存在一至幾個(gè)F質(zhì)粒，并在細(xì)胞表面著生一至幾條性菌毛的菌株。當(dāng)F+菌株與F-菌株接觸時(shí)，通過(guò)性菌毛的溝通和收縮，F(xiàn)質(zhì)粒由F+菌株由“滾環(huán)模型”轉(zhuǎn)移至F-菌株中，同時(shí)F+菌株中的F質(zhì)粒也獲得復(fù)制，使兩者都成為F+菌株。F因子以很高的頻率傳遞，但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般并不被轉(zhuǎn)移。F+×F–