第1章 酶制劑工業(yè)概論

酶技術(shù)與應(yīng)用

第1章酶制劑工業(yè)概論江南大學(xué)生物工程學(xué)院

2012年2月

山東青島主要內(nèi)容1.1酶的定義和本質(zhì)1.2酶的研究簡(jiǎn)史1.3酶的一般特征1.4酶的分類和命名1.5酶對(duì)食品科學(xué)的重要性1.6酶制劑的安全評(píng)價(jià)1.7最新的法規(guī)生物技術(shù)的四大支柱基因工程：用“剪刀+糨糊”創(chuàng)造新物種的工程。細(xì)胞工程：微觀水平的嫁接技術(shù)。酶工程：讓工廠高效、安靜、美麗如畫(huà)的工程。發(fā)酵工程：把微生物或細(xì)胞造就成無(wú)數(shù)微型工廠，將神話變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)的橋梁。酶工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的主要組成部分，利用酶、含酶細(xì)胞器或細(xì)胞（微生物、植物、動(dòng)物）作為生物催化劑來(lái)完成某些重要的化學(xué)反應(yīng)。應(yīng)用范圍包括醫(yī)藥、食品、化學(xué)工業(yè)、診斷分析和生物傳感器等。隨著酶的大量應(yīng)用，各種酶反應(yīng)器與固定化技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展，也推動(dòng)了酶工程的發(fā)展。酶工程發(fā)展的趨勢(shì)之一是尋找耐極端條件（高溫、酸或堿、鹽等）的酶，將為酶工業(yè)提供有用的新酶類。酶工程的定義及分類

酶工程指酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用

化學(xué)酶工程生物酶工程化學(xué)酶工程(亦稱初級(jí)酶工程)主要由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)相互結(jié)合而形成

化學(xué)修飾固定化處理

化學(xué)合成法

自然酶

化學(xué)修飾酶

固定化酶

化學(xué)人工酶改善酶的性質(zhì)以及提高催化效率及降低成本研究和應(yīng)用食品工業(yè)、制藥工業(yè)等-----使用自然酶醫(yī)學(xué)上治療及研究-----對(duì)純酶進(jìn)行化學(xué)修飾以改善性能固定化酶-----指被結(jié)合到特定的支持物上并能發(fā)揮作用的一類酶。是化學(xué)酶工程中具有強(qiáng)大生命力的主干。

四種方法

吸附

交聯(lián)

共價(jià)結(jié)合

包埋優(yōu)點(diǎn)：

（1）可以用離心法或過(guò)濾法很容易地將酶與反應(yīng)液分離開(kāi)來(lái)。在生產(chǎn)中十分方便有利

（2）可以反復(fù)使用,達(dá)上千次,節(jié)約成本

（3）穩(wěn)定性能好人工酶-----模擬酶的生物催化功能，用化學(xué)半合成法或化學(xué)全合成法合成的酶稱人工酶生物酶工程

在化學(xué)酶工程基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，是以酶學(xué)和DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。亦稱高級(jí)酶工程。三個(gè)方面：

（1）用DNA重組技術(shù)大量地生產(chǎn)酶（克隆酶）

（2）對(duì)酶基因進(jìn)行修飾，產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）

（3）設(shè)計(jì)新的酶基因，合成自然界不曾有過(guò)的能穩(wěn)定、催化效率更高的新酶1.1酶的定義和本質(zhì)什么是酶？酶——活細(xì)胞產(chǎn)生的，能在細(xì)胞內(nèi)外起作用的（催化）生理活性物質(zhì)。enzyme—organicchemicalsubstance(acatalyst)formedinlivingcells,abletocausechangesinothersubstancewithoutbeingchangeditself.什么是酶制劑？

GB25594—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品工業(yè)用酶制劑中規(guī)定：酶制劑是指動(dòng)物或植物的可食或非可食部分直接提取，或由傳統(tǒng)或通過(guò)基因修飾的微生物（包括但不限于細(xì)菌、放線菌，真菌菌種）發(fā)酵、提取制得，用于食品加工，具有特殊催化功能的生物制品。酶的化學(xué)本質(zhì)1．大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)（Mostenzymesareproteins）1926年美國(guó)Sumner脲酶的結(jié)晶，并指出酶是蛋白質(zhì)1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的結(jié)晶，并進(jìn)一步證明了酶是蛋白質(zhì)。J.B.SumnerJ.H.Northrop酶的化學(xué)本質(zhì)？2．某些RNA有催化活性1982年美國(guó)T.Cech等人發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)的rRNA前體能在完全沒(méi)有蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行自我加工，發(fā)現(xiàn)RNA有催化活性ThomasCechUniversityofColoradoatBoulder,USA

20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)某些RNA有催化活性，還有一些抗體也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)概念受到很大沖擊。1.2酶的研究簡(jiǎn)史酶的研究處于生物學(xué)和化學(xué)的銜接點(diǎn)，是一門內(nèi)容廣泛、發(fā)展迅速的科學(xué)。它的分支遍及很多領(lǐng)域，并與許多學(xué)科緊密聯(lián)系，特別同生物化學(xué)、物理化學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物工程、醫(yī)學(xué)以及生理學(xué)等的關(guān)系更為密切。由于酶獨(dú)特的催化功能，近年來(lái)已在食品、輕工、化工、醫(yī)藥、環(huán)保、能源和科學(xué)研究等各個(gè)領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用。1.2.1酶的早期研究4000多年前，人們就已經(jīng)在釀酒、制飴、制醬等過(guò)程中不自覺(jué)地利用了酶的催化作用。在我國(guó)古書(shū)《書(shū)經(jīng)》中有“若作酒醴[lǐ],爾維麴[qū]蘗[niè]”的記載，其意為：若要釀酒，就必須使用麴和蘗。麴是指長(zhǎng)了微生物的谷物，蘗是指發(fā)了芽的谷物，它們都含有豐富的酶。西方各國(guó)在17世紀(jì)也有了關(guān)于酶的記載。然而，人們真正認(rèn)識(shí)酶的存在和作用，是從19世紀(jì)開(kāi)始的。1833年法國(guó)化學(xué)家Payen和Persoz從麥芽提取物中首次發(fā)現(xiàn)了淀粉酶，他們將這種由酒精沉淀后得到的可使淀粉水解成可溶性糖的物質(zhì)命名為淀粉糖化酵素，并指出了它的熱不穩(wěn)定性，初步觸及了酶的一些本質(zhì)問(wèn)題。到19世紀(jì)中期，科學(xué)家們已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了胃蛋白酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶和轉(zhuǎn)化酶等。1855年，Schoenbein在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了過(guò)氧化物酶，由此解決了愈創(chuàng)樹(shù)脂變色的難題。在1856年，Schoenbein又在蘑菇中發(fā)現(xiàn)了另外一種酶——多酚氧化酶，能夠在氧存在的條件下催化反應(yīng)生成有色氧化物。另外，在這個(gè)時(shí)期，許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)酶的催化作用與酵母在發(fā)酵期間的作用相似，因而微生物學(xué)家巴斯德（Pasteur）和化學(xué)家李比希（Liebig）提出了兩種不同觀點(diǎn)。巴斯德主張：發(fā)酵和活細(xì)胞有關(guān)，酒精發(fā)酵是酵母細(xì)胞生活的結(jié)果。巴斯德（1822-1895）微生物學(xué)的奠基人創(chuàng)立了發(fā)酵的生物學(xué)理論，低溫消毒技術(shù)（巴氏殺菌）免疫學(xué)--預(yù)防接種，研制出狂犬疫苗李比希認(rèn)為：發(fā)酵及其他類似過(guò)程，是由于化學(xué)物質(zhì)的作用，純粹是化學(xué)過(guò)程。從1901年到1910年最早的十次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者中，李比希的學(xué)生就有七位。李比希(1803—1873)德國(guó)化學(xué)家關(guān)于發(fā)酵本質(zhì)的長(zhǎng)期論戰(zhàn)1897年，布希納兩兄弟(EduardBuchner&HansBuchner)成功的從酵母細(xì)胞分離出具有發(fā)酵作用的物質(zhì)，能使糖發(fā)酵。他們當(dāng)時(shí)的興趣是制備用于治療疾病的酵母無(wú)細(xì)胞提取物，這些提取物的保存必須不加防腐劑,例如不能加酚,于是他們決定試用蔗糖，這是在烹調(diào)化學(xué)中常用的防腐劑。他們得到了驚人的結(jié)果:酵母汁液迅速將蔗糖發(fā)酵產(chǎn)生了酒精。這說(shuō)明巴斯德和李比希的兩種觀點(diǎn)實(shí)質(zhì)上是一致的。生物化學(xué)就是在解決發(fā)酵本質(zhì)的著名論戰(zhàn)中產(chǎn)生的。HansBuchner（1850-1902）德國(guó)細(xì)菌學(xué)家EduardBuchner(1860-1917)1907年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)Enzyme的詞源而“酶”（Enzyme）的概念，是由德國(guó)科學(xué)家?guī)於髂?Kuhne)在1878年首先提出，用以表示未統(tǒng)一名稱的已知的各種酵素。enzyme本身的意思是“在酵母中”，起源于希臘語(yǔ)，其中en表示“在之內(nèi)”，zyme表示“酵母或酵素”。1.2.2酶催化的專一性在大量實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，F(xiàn)ischer于1894年提出了“鎖和鑰匙”模型，成功解釋了酶的催化反應(yīng)機(jī)制。酶催化專一性理論研究的另一重要成就是1959年Koshland提出的“誘導(dǎo)契合”理論，以解釋酶的催化理論和專一性，同時(shí)也搞清了某些酶的催化活性與生理?xiàng)l件變化有關(guān)。1.2.3酶的純化和固定化酶的純化在1920年后取得了重大的突破。1926年美國(guó)人Sumner首先從刀豆中獲得了不負(fù)載任何其他催化劑的脲酶蛋白質(zhì)結(jié)晶，從此確立了酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的觀點(diǎn)，為酶的理化特性研究奠定了基礎(chǔ)。20世紀(jì)30年代掀起了酶結(jié)晶研究的熱潮。最有代表性的成果是1930年至1936年間Northrop等人制取了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A的結(jié)晶。人們已經(jīng)獲取了上百種酶的結(jié)晶，另外還有超過(guò)600種酶被提取純化。目前為止，已發(fā)現(xiàn)自然界存在的酶有3000多種，但真正形成工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的只有幾十種。因此，當(dāng)今酶的研究開(kāi)發(fā)具有廣闊的發(fā)展前景。隨著酶生產(chǎn)的發(fā)展，酶的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。在生產(chǎn)應(yīng)用過(guò)程中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)酶的穩(wěn)定性較差、不能重復(fù)使用等不足之處。于是，為了更好地發(fā)揮酶的催化功能，人們開(kāi)始嘗試對(duì)酶進(jìn)行分子修飾，即通過(guò)各種方法，使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而使酶的某些特性和功能發(fā)生改變，以滿足人們對(duì)酶應(yīng)用的要求。其方法之一就是固定化酶的研究。酶的純化和固定化1.3酶的一般特征酶既然是生物催化劑，它就具有催化劑一般的特征。酶和一般催化劑一樣，只能催化熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)，因?yàn)樵诜磻?yīng)中其本身不被消耗，因此有極少量就可大大加速化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。它對(duì)化學(xué)反應(yīng)正逆兩個(gè)方向的催化作用是相同的。所以它可以縮短平衡到達(dá)的時(shí)間，而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。但酶和一般催化劑比較，又有其不同之處。1.3.1酶的催化效率高酶的一個(gè)突出的特點(diǎn)是催化效率極高。同一反應(yīng)，酶催化反應(yīng)的速度比一般催化劑催化的反應(yīng)速度要大106～1013倍。有極少量酶就可催化大量反應(yīng)物發(fā)生轉(zhuǎn)變。1.3.2酶作用的專一性酶的另外一個(gè)特點(diǎn)是它具有高度的專一性。酶對(duì)其所作用的物質(zhì)（稱為底物）有著嚴(yán)格的選擇性。一種酶僅能作用于一種物質(zhì)，或一類分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，促其進(jìn)行一定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生一定的反應(yīng)產(chǎn)物，這種選擇性作用稱為酶的專一性。酶的專一性是酶的特性之一。例如，蛋白酶只能催化蛋白質(zhì)的水解，酯酶只催化酯類的水解，而淀粉酶只能催化淀粉的水解。若用一般催化劑，對(duì)作用物的要求就不那么嚴(yán)格，以上三類物質(zhì)都可以在酸或堿的催化下水解。1.3.3大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)酶是由生物活細(xì)胞產(chǎn)生的有催化能力的蛋白質(zhì)，只要不是處于變性狀態(tài)，無(wú)論是在細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外都可發(fā)揮催化作用。目前在食品工業(yè)應(yīng)用的酶也都是蛋白質(zhì)。紫外線、熱、表面活性劑、重金屬鹽以及酸堿變性劑等能使蛋白質(zhì)變性的因素，往往也能使酶失效。酶本身能被水解蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解酶分解而喪失活性。酶在生活細(xì)胞中產(chǎn)生，但有些酶被分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。如人和動(dòng)物消化管中以及某些細(xì)菌所分泌的水解淀粉，脂肪和蛋白質(zhì)的酶，這類酶稱胞外酶。其他大部分酶在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱為胞內(nèi)酶。這些酶在細(xì)胞內(nèi)常與顆粒體結(jié)合，并有著一定的分布。如線粒體上分布著三羧酸循環(huán)酶系和氧化磷酸化酶系，而蛋白質(zhì)生物合成的酶系則分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上。1.4酶的分類和命名1833年P(guān)ayen和Persoz發(fā)現(xiàn)麥芽提取液的酒精沉淀物中包含一種熱敏性物質(zhì)可將淀粉水解變?yōu)樘?，由于其能從不可溶的淀粉顆粒中分離出可溶性的糊精，他們將此物質(zhì)命名為“diastase”意思是“分離”（中文現(xiàn)譯為“淀粉酶”），這樣隨意的方式成為酶命名的開(kāi)端，后來(lái)命名一種酶時(shí)常加詞尾“ase”。在隨后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，出現(xiàn)了各種各樣的命名方式。有根據(jù)純化后酶的顏色來(lái)命名的，如老黃酶（oldyellowenzyme）；有根據(jù)酶的來(lái)源命名的，如無(wú)花果蛋白酶（ficin），胃蛋白酶（pepsin）；有根據(jù)酶作用的底物來(lái)命名的，如果膠酶（pectase）。1955年，為避免酶的命名混亂，當(dāng)時(shí)的國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)（現(xiàn)發(fā)展為國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)，IUBMB）決定成立了國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（EnzymeCommission）以規(guī)范酶的命名。http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/酶學(xué)委員會(huì)提出的命名規(guī)則酶學(xué)委員會(huì)提出以酶所催化的化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)作為酶的分類和命名規(guī)則的主要依據(jù)，每一種酶都有三個(gè)名稱：系統(tǒng)名，慣用名和一個(gè)數(shù)字編號(hào)。系統(tǒng)名要求能確切地表明底物的化學(xué)本質(zhì)及酶的催化性質(zhì)，它包括兩部分，底物名稱及反應(yīng)類型。若酶催化的反應(yīng)中有兩種底物起反應(yīng)，則這兩種底物均需表明，當(dāng)中用“：”隔開(kāi)，例如多酚氧化酶其系統(tǒng)名稱為：1,2-苯二酚：氧氧化還原酶。慣用名慣用名不需要非常的精確，要求比較簡(jiǎn)短，使用方便，一般根據(jù)酶所作用的底物名稱、催化的反應(yīng)性質(zhì)、酶的來(lái)源或其他特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行命名。許多酶的慣用名是延用系統(tǒng)命名之前就使用的名稱。酶的數(shù)字編號(hào)系統(tǒng)系統(tǒng)酶的數(shù)字編號(hào)系統(tǒng)系統(tǒng)根據(jù)酶所催化反應(yīng)的類型將酶分為6大類，并以4個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字來(lái)對(duì)每一種酶進(jìn)行編號(hào)。例如乙醇脫氫酶，編號(hào)為EC。EC是指酶學(xué)委員會(huì)（EnzymeCommission）。第一個(gè)數(shù)字代表酶的6個(gè)大分類，以1，2，3，4，5，6來(lái)分別代表如下6大酶類：（1）氧化還原酶（Oxidoreductases）——催化氧化還原反應(yīng)；（2）轉(zhuǎn)移酶（Transferases）——催化分子間基團(tuán)轉(zhuǎn)移的反應(yīng)；（3）水解酶（Hydrolases）——催化水解反應(yīng)；（4）裂合酶（Lyases）——催化非水解地除去底物分子中的基團(tuán)及其逆反應(yīng)；（5）異構(gòu)酶（Isomerases）——催化分子的異構(gòu)反應(yīng)；（6）連接酶（Ligases）（也稱為合成酶）——催化兩分子連接的反應(yīng)，反應(yīng)中酶與ATP的一個(gè)焦磷酸鍵相偶聯(lián)。酶名稱的使用建議：系統(tǒng)名一般都比較長(zhǎng)，使用起來(lái)不方便，在許多場(chǎng)合下仍采用慣用名。但在科技文獻(xiàn)中，當(dāng)一種酶作為主要研究對(duì)象時(shí)，應(yīng)在文中第一次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明其系統(tǒng)名、數(shù)字編號(hào)以及酶的來(lái)源。例如乙醇脫氫酶在文中第一次出現(xiàn)時(shí)應(yīng)標(biāo)明“乙醇：NAD+氧化還原酶（EC），來(lái)源于酵母”，其后則可以使用慣用名“乙醇脫氫酶”。如果酶不是文獻(xiàn)中的主要研究對(duì)象（例如只是作為試劑使用），則只需在第一次出現(xiàn)時(shí)在慣用名后的括號(hào)中標(biāo)明酶的數(shù)字編號(hào)如“乙醇脫氫酶EC）”1.5酶對(duì)食品科學(xué)的重要性酶的應(yīng)用已有幾千年的歷史，盡管那時(shí)人們并沒(méi)有任何有關(guān)催化劑和化學(xué)反應(yīng)本質(zhì)方面的知識(shí)，但在這些食品的制作加工過(guò)程中，人們已經(jīng)開(kāi)始不自覺(jué)地利用微生物細(xì)胞產(chǎn)生的各種酶的催化作用。例如：在釀造中利用發(fā)芽的大麥轉(zhuǎn)化淀粉，用破碎的木瓜樹(shù)葉包裹肉以使肉嫩化，都是古代食品制備中應(yīng)用酶的例子。而這些利用酶進(jìn)行食品生產(chǎn)的古老技術(shù)也已代代相傳至今。酶學(xué)和食品科學(xué)的關(guān)系是十分密切的。早在科學(xué)家們最初開(kāi)始研究消化、發(fā)酵和水解反應(yīng)中的酶時(shí)就都涉及到了食品。很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，食品科學(xué)家們對(duì)酶在食品中的各種作用，尤其是導(dǎo)致食品變質(zhì)敗壞的酶作用進(jìn)行了細(xì)致研究近幾十年來(lái)隨著酶研究的不斷深入和酶生產(chǎn)的快速發(fā)展，酶在食品科學(xué)的重要性日益凸現(xiàn)。1.5.1酶對(duì)食品生產(chǎn)的重要性（1）控制動(dòng)植物原料中的酶（2）利用酶的催化活性進(jìn)行生產(chǎn)活動(dòng)1.5.2酶對(duì)食品安全的重要性酶具有改善食品品質(zhì)和加工性能，酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用日益深入和廣泛，極大地促進(jìn)了酶制劑工業(yè)的發(fā)展。然而酶的來(lái)源及其性質(zhì)也關(guān)乎食品質(zhì)量安全，特別是隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)基因工程手段改造部分微生物的基因，從而改變酶蛋白的基本結(jié)構(gòu)，達(dá)到強(qiáng)化酶在某方面功能特性目的的做法已成為商業(yè)上成功的典范，同時(shí)，這種做法給食品酶的應(yīng)用帶來(lái)安全隱患。對(duì)食品工業(yè)用酶制劑生產(chǎn)及應(yīng)用進(jìn)行安全衛(wèi)生管理，從而建立一套科學(xué)使用規(guī)范及酶制劑安全性評(píng)價(jià)體系。酶與食品質(zhì)量安全酶存在于所有的新鮮食品當(dāng)中，例如堅(jiān)果、乳、奶油、干酪、新鮮水果和蔬菜、未燒煮的肉、魚(yú)和蛋中都富含各種酶類。當(dāng)人們食用這些食品時(shí)，相當(dāng)數(shù)量的酶就攝入人體中。在攝入的酶中，不僅有動(dòng)物和植物來(lái)源的，而且還有微生物來(lái)源的。在發(fā)酵和腌制食品中，例如干酪、酸奶、啤酒和腌黃瓜，就含有微生物來(lái)源的酶。作為微生物來(lái)源的食品酶制劑，通常除了包括酶蛋白本身以外，還含有微生物的代謝產(chǎn)物，以及添加的保存劑和穩(wěn)定劑。如果將加入食品中的酶看作為食品添加劑，那么就應(yīng)該考慮到衛(wèi)生和安全方面的問(wèn)題。酶制劑作為食品添加劑進(jìn)入食品的潛在危害酶不僅來(lái)源于動(dòng)植物，也有來(lái)源于微生物的，酶與其他混入酶制劑的蛋白質(zhì)，作為外源蛋白質(zhì)在隨同食品進(jìn)入人體后，有可能引起過(guò)敏反應(yīng)，雖然目前還極少見(jiàn)這樣的例子，但在新的酶制劑出現(xiàn)時(shí)必須以予考慮。另外，來(lái)源于微生物的酶制劑也可能