理學現(xiàn)代生物技術細胞工程

細胞工程的基本原理1

植物細胞工程2

微生物細胞工程4第三章細胞工程

動物細胞工程3

第一節(jié)細胞工程的基本原理

一、細胞工程的內(nèi)容

（1）定義應用細胞生物學的方法，在體外條件下以細胞為基本單位進行培養(yǎng)、繁殖，或人為地使細胞某些生物學特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達到改良生物品種和創(chuàng)造新品種，加速繁殖動、植物個體，或獲得某種有用的物質(zhì)的過程。一、細胞工程的內(nèi)容根據(jù)其研究對象不同，分為植物細胞工程、動物細胞工程和微生物細胞工程。細胞是細胞工程操作的主要對象。原核細胞細菌、放線菌真核細胞酵母菌、動物細胞、植物細胞細胞工程植物細胞工程動物細胞工程植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交動物細胞培養(yǎng)動物細胞融合單克隆抗體胚胎移植核移植微生物細胞工程微生物細胞培養(yǎng)微生物細胞雜交二、發(fā)展史1838～1839年提出細胞學說；

1902年提出細胞全能性；

細胞全能性：植物細胞具有原植物的全部遺傳性，單細胞經(jīng)人工培養(yǎng)，通過細胞分裂而恢復成完整植株。

1904年用胡蘿卜胚培養(yǎng)成株，三十年代獲愈傷組織。

1948年發(fā)現(xiàn)腺嘌呤，生長素對芽形成的影響，建立腺嘌呤/生長素的比例控制芽根分化。二、發(fā)展史1956年發(fā)現(xiàn)激動素促芽形成效果高，促組培工作研究；

六十年代從曼陀蘿花藥培養(yǎng)獲植株建花培技術；

1972年細胞融合成功；

1912年培養(yǎng)動物細胞；

1958年獲細胞融合（種間、腹水癌細胞+病毒）

六十年代初換核術成功；

1975年獲雜交瘤；

我國70年代中開始細胞融合；

現(xiàn)有40多種花粉植株，在我國首次成功。三、細胞工程的基本操作無菌操作技術細胞培養(yǎng)技術細胞融合技術1、無菌操作技術

細胞工程的所有實驗都要求在無菌條件下進行，實驗操作成在無菌室內(nèi)進行。無菌室應定期用紫外線或化學試劑消毒，實驗前后還應各消毒一次。無菌室外有間緩沖室，實驗人員在此換鞋、更衣、戴帽，做好準備后方可進入無菌室，操作時實驗者的雙手應戴無菌手套。注意周圍環(huán)境的衛(wèi)生整潔。生物材料、一切器械、器皿和藥品應進行滅菌或除菌。

無菌操作殺菌和消毒物理法化學試劑抗生素超凈工作臺2、細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)是指動物、植物和微生物細胞在體外無菌條件下的保存和生長。雖然這些細胞培養(yǎng)在營養(yǎng)要求等方面有許多差異，但作為細胞培養(yǎng)，它們也有些共同之處。首先，要取材和除菌。除了淋巴細胞可直接抽取以外，植物材料在取材后，動物材料在取材前都要用一定的化學試劑進行嚴格的表面清洗、消毒。有時還需要某些特定的酶對材料進行頂處理，以期得到分散生長的細胞。其次，根據(jù)各類細胞的特點，配制細胞培養(yǎng)基并進行滅菌。將生物材料接種于培養(yǎng)基中，最后將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞達到一定生物量時應及時收獲或傳代。3、細胞融合技術兩個或多個細胞相互接觸后，其細胞膜發(fā)生分子重排，導致細胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為細胞融合。細胞融合是細胞工程的重要基本技術，其主要過程包括：①制備原生質(zhì)體。由于微生物及植物細胞具堅硬的細胞壁，因此通常需用酶將細胞壁降解。動物細胞則無此障礙。②誘導細胞融合。兩親本細胞(原生質(zhì)體)的懸浮液調(diào)至一定細胞密度；按1：1的比例混合后，用物理、化學或生物的方法促進融合。③篩選雜合細胞。將上述混合液移到特定的篩選培養(yǎng)基上，讓雜合細胞有選擇地長出，其他未融合細胞無法生長。以獲得具有雙親遺傳特性的雜合細胞。細胞融合技術制備原生質(zhì)體誘導細胞融合化學法物理法生物法篩選雜合細胞

四、細胞培養(yǎng)技術

1、微生物細胞培養(yǎng)

2、植物細胞培養(yǎng)

3、動物細胞培養(yǎng)

1、微生物細胞培養(yǎng)1）培養(yǎng)基的組成碳源氮源無機鹽維生素水1）培養(yǎng)基的組成碳源蔗糖、萄葡糖、果糖、麥芽糖、纖維二糖或多糖類的可溶性淀粉、糊精及果膠；由其他谷物、馬鈴薯、紅薯、木薯等得到的糖類物質(zhì)。

作用：維持培養(yǎng)基的合適滲透壓；

構造微生物體；

參與新陳代謝。

注意:不同濃度影響細胞的增殖分化。1）培養(yǎng)基的組成氮源來源：無機氮源（氨氣、銨鹽或硝酸鹽等）和有機氮源（氨基酸、蛋白質(zhì)或尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等）。

作用：構成微生物細胞、蛋白質(zhì)和核酸的主要元素。細胞生長分化需氮。

1）培養(yǎng)基的組成

無機鹽大量元素：每升培養(yǎng)基含0.5毫摩爾以上。

微量元素：每升培養(yǎng)基含0.5毫摩爾以下。

大量元素：P、K、Mg、S、Ca等；

微量元素：鈷、銅、鐵、錳、鉬、鋅等。

作用：構成菌體的組成；作為酶活性基團的組成部分；調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)的pH值。1）培養(yǎng)基的組成維生素維生素是生物體生長不可缺少的一種或數(shù)種極微量的有機物質(zhì)，但微生物在生長時，自身往往又缺乏合成這種有機物的能力，因此，必須由外界提供。與微生物關系較大的維生素，主要是B族維生素。作用：是微生物體內(nèi)各種酶活性基團的組成部分。直接參與生物催化劑——酶的形成及蛋白質(zhì)、脂肪的代謝。1）培養(yǎng)基的組成維生素C（抗壞血酸）：強還原能力，防組

織氧化變褐。

B1（硫胺素）：促愈傷組織產(chǎn)生，與愈傷

組織活力有關。

B2（煙酸或維生素PP）：促代謝，促胚的

發(fā)育，高濃度會抑制生長。

B6（吡哆醇）：促根生長。

肌醇（環(huán)己六醇）：無促進生長的作用，

但有助活性物質(zhì)發(fā)揮作用。1）培養(yǎng)基的組成水培養(yǎng)基大部分是水

來源：不含或少含某些離子的重蒸水（雙蒸水）或去離子水。

目的：保持培養(yǎng)基成分完全人為控制。作用：起媒介作用

組成作物體（占75～80%）

提供O、H元素

運輸物質(zhì)、調(diào)節(jié)滲透壓2）培養(yǎng)基的種類按成分不同劃分：

天然培養(yǎng)基：含有化學成分還不清楚或化學成分不恒定的天然有機物。

合成培養(yǎng)基：由化學成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。根據(jù)物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基2）培養(yǎng)基的種類按用途劃分：基礎培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基（營養(yǎng)培養(yǎng)基）鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基其他培養(yǎng)基：分析培養(yǎng)基、還原性培養(yǎng)基等3）培養(yǎng)方法（1）固體培養(yǎng)；（2）液體培養(yǎng)；（3）連續(xù)培養(yǎng)；（4）中間補料培養(yǎng)；（5）同步培養(yǎng)；（6）混合培養(yǎng)。2、植物細胞培養(yǎng)

廣義的植物細胞培養(yǎng)是指在無菌條件下，將離體的單個游離細胞在人工控制的環(huán)境里培養(yǎng)，以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他生物產(chǎn)品的一種技術。食品工業(yè)意義上的植物細胞培養(yǎng)主要是指細胞懸浮培養(yǎng)，即使游離的植物細胞或一些小的細胞團在液體培養(yǎng)基中增殖并分離提取細胞產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。2、植物細胞培養(yǎng)植物細胞體系建立的一般程序為：整體植株株——植物組織或器官——外植體——在固體培養(yǎng)基上誘發(fā)愈傷組織——愈傷組織繼代培養(yǎng)——懸浮培養(yǎng)。2、植物細胞培養(yǎng)基本操作過程：一般利用次亞氯酸鹽的稀溶液、酒精、升汞等消毒劑對合適的植物材料進行表面消毒滅菌，在無面條件下切取未受損傷或未被污染的組織或器官(即外植體)，置于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨著細胞增殖形成不定型細胞團(即愈傷組織)，將此愈傷組織移入新鮮固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)或轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。愈傷化時間隨植物種類和培養(yǎng)基條件不同而不同，慢的需要幾周以上，一旦增殖開始，就可反復繼代培養(yǎng)，加速細胞生殖。繼代培養(yǎng)可用試管或燒瓶等，大規(guī)模懸浮培養(yǎng)可用傳統(tǒng)的攪拌罐、氣式發(fā)酵罐。2、植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)與動物細胞培養(yǎng)相比，具最大的優(yōu)點是植物細胞能在簡單的合成培養(yǎng)基上生長。其培養(yǎng)基的成分由無機鹽類、碳源、維生素、植物生長激素、有機氮源、有機酸和一些復合物質(zhì)組成。包括植物生長所必需的16種營養(yǎng)元素和某些生理活性物質(zhì)。2、植物細胞培養(yǎng)

植物細胞培養(yǎng)方法單細胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)；固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（搖瓶懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模懸浮培養(yǎng)）。懸浮培養(yǎng)是指把離體的植物細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進行的無菌培養(yǎng)。2、植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)方法1）植物細胞懸浮培養(yǎng)法分批培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)法2、植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)方法2）植物細胞固定化培養(yǎng)技術

所謂固定化細胞培養(yǎng)，即把細胞固定在一種惰性基質(zhì)，如瓊脂、藻酸鹽、聚丙烯酰胺、纖維或膜上面或里面，細胞不能運動，而營養(yǎng)液可以在細胞間流動，供應其營養(yǎng)。常用的細胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)平床培養(yǎng)系統(tǒng)立柱培養(yǎng)系統(tǒng)3、動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)是指離散的動物活細胞體外人工無菌條件下的生長增殖，在整個過程中細胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。根據(jù)細胞是否貼附于支持物上生長的特性，培養(yǎng)的細胞可分為兩大類：懸浮型和貼附型。懸浮型細胞是指生長時呈懸浮狀態(tài)的細胞；貼附型是指貼附于支持物上生長的細胞。動物細胞培養(yǎng)的一般程序是：組織切碎-酶處理得單個細胞-培養(yǎng)-再擴大培養(yǎng)。3、動物細胞培養(yǎng)1）細胞培養(yǎng)基的組成氨基酸維生素鹽：鈉、鉀、鎂、鈣、氯等金屬離子和酸根離子葡萄糖有機添加劑激素和生長因素3、動物細胞培養(yǎng)2）常用培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基3、動物細胞培養(yǎng)3）動物細胞培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)法五、細胞融合技術細胞融合技術是指在一定條件下，將兩個或多個細胞融合在一個細胞的過程，細胞融合又稱細胞雜交。五、細胞融合技術1.細胞融合的方法

生物學法化學融合劑法電處理融合法五、細胞融合技術2.微生物原生質(zhì)體的制備與融合

1）微生物原生質(zhì)體的制備為制備微生物的原生質(zhì)體，必須有效地去除細胞壁，根據(jù)各種微生物細胞壁的不同結構和組成，可以用不同的方法來脫壁。目前，常用酶法來脫壁。五、細胞融合技術2.微生物原生質(zhì)體的制備與融合

1）微生物原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體制備之前，微生物細胞需經(jīng)過種子培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)到一定的對數(shù)生長期，其菌量約為菌懸浮液中4×l08個／mL時為宜，然后加溶菌酶在42℃輕輕振蕩45min即形成原生質(zhì)體，由于原生質(zhì)體對滲透壓敏感，因此在瓊脂培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，原生質(zhì)體會在低滲條件下破裂失活，不能形成菌落，曲落越少說明原生質(zhì)體化效果愈好。原生質(zhì)體形成率＝原生質(zhì)休數(shù)/未經(jīng)酶處理的總菌數(shù)。五、細胞融合技術2.微生物原生質(zhì)體的制備與融合

2）微生物原生質(zhì)體融合和再生融合是把兩親本的原生質(zhì)體混合在一起，采用不同的方法進行，最常用的是PEG融合和電融合。融合率＝融合子/兩親本原生質(zhì)體再生菌落的總數(shù)五、細胞融合技術3.植物原生質(zhì)體的制備

1）取材與除菌

2）酶解

3）分離

4）洗滌

5）鑒定五、細胞融合技術4.融合子的篩選

1）微生物融合子的篩選

2）植物融合子的鑒定

3）動物細胞融合子的鑒定作業(yè)1.什么是細胞工程？2.植物細胞培養(yǎng)的方法有哪些？第二節(jié)植物細胞工程植物細胞工程：以植物細胞為基本單位，在離體條件下進行培養(yǎng)、繁殖或人為地精細操作，使細胞的一些生物學特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而達到改良品種或生產(chǎn)生物產(chǎn)品的目的的一種技術。植物細胞工程通常采用的技術手段

植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交所采用技術的理論基礎植物細胞的全能性細胞的全能性：生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能的特性。

生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因，從理論上講，生物體的每一個活細胞都應該具有全能性。脫分化：已分化（或成熟）的組織又恢復到無分化的初始狀態(tài)。

在組織培養(yǎng)過程中，將已經(jīng)分化的莖、葉、花等外植體進行培養(yǎng)，使其形成愈傷組織，回復到?jīng)]有分化的狀態(tài)。再分化：在組織培養(yǎng)過程中，對處于脫分化狀態(tài)的愈傷組織進行培養(yǎng)，誘導其形成新的植物體的過程。外植體：在植物組織培養(yǎng)過程中，從植物體上被分離下來接種到培養(yǎng)基上，供培養(yǎng)用的原生質(zhì)體、細胞、組織、器官等。

建立外植體的過程：從植物組織（根尖、莖、芽、嫩葉、種子、花粉等）分離外植體→滅菌消毒→切取并將外植體接種于培養(yǎng)基上愈傷組織：在培養(yǎng)基中，外植體切口處不斷增殖產(chǎn)生的一團不定形的薄壁組織就是愈傷組織。

愈傷組織可使傷口愈合，保護表面細胞；植物扦插時，愈傷組織可形成不定根；植物嫁接時，愈傷組織可使接穗和砧木愈合；在植物組織培養(yǎng)中，愈傷組織可形成不定芽或不定根。初代培養(yǎng)：在組織培養(yǎng)過程中，最初建立的外植體的無菌培養(yǎng)階段。繼代培養(yǎng)：在組織培養(yǎng)過程中，當外植體被接種一段時間后，將已經(jīng)形成愈傷組織或已經(jīng)分化出根、莖、葉、花等的培養(yǎng)物重新切割，轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上以進一步擴大培養(yǎng)的過程。試管苗：在無菌條件下的人工培養(yǎng)基上，對植物細胞、組織或器官進行培養(yǎng)所獲得的再生植株。

外植體愈傷組織新植株科學研究表明，處于離體狀態(tài)的植物活細胞，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。人工條件下實現(xiàn)的這一過程，就是植物組織培養(yǎng)。一、植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)：通過無菌操作分離植物體的一部分作為外植體，接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下（包括培養(yǎng)條件、激素、溫度、光照、濕度等）進行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株或者獲得次生代謝產(chǎn)物的過程。外植體愈傷組織新植株過程：初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)最終產(chǎn)品形式：試管苗或細胞代謝產(chǎn)物培養(yǎng)條件：光照、溫度、相對濕度應用：試管苗的快速繁殖、無病毒植物的培育、提取次生代謝產(chǎn)物、人工種子的培育、轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)等。一、植物組織培養(yǎng)進行植物組織培養(yǎng)，一般要經(jīng)歷以下五個階段：1外植體的選擇及培養(yǎng)。2誘導去分化階段。3繼代增殖階段。4誘導分化生根成芽階段。5移栽成活階段。離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織根芽植物體脫分化再分化脫分化由高度分化的植物器官、組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化。再分化脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)又可以重新分化成根或芽等器官，這一過程稱為植物細胞的再分化。植物組織培養(yǎng)過程離體植物細胞愈傷組織胚狀體根芽植物體脫分化再分化

植物組織培養(yǎng)應用舉例（一）

紫草紫草素

愈傷組織

植物組織培養(yǎng)應用舉例（二）胚狀體人工種皮人工胚乳

植物組織培養(yǎng)應用舉例（三）人工種子二、植物細胞培養(yǎng)

在離體條件下，將愈傷組織或者其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖，從而獲得大量的細胞群體的一種技術。三.植物細胞雜交（細胞融合）1960年英國諾丁漢大學Cocking教授領導的小組率先利用真菌纖維素酶，成功地制備出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根細胞原生質(zhì)體,開辟了原生質(zhì)體融合研究的新階段。植物細胞雜交的主要過程：1.原生質(zhì)體的制備。2.原生質(zhì)體的融合。3.雜合體的鑒別與篩選。植物A細胞植物B細胞去壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合融合體再生壁雜種細胞細胞分裂愈傷組織雜種植株去壁的常用方法：酶解法（纖維素酶、果膠酶等）

原生質(zhì)體融合方法：物理法：離心、振動、電刺激等化學法：聚乙二醇（PEG）植物體細胞雜交

過程(1)(1)(2)(3)(4)(5)

植物體細胞雜交過程示意圖白菜甘藍白菜－甘藍植物體細胞雜交應用作業(yè)1.什么是植物細胞工程？2.簡述植物組織培養(yǎng)的幾個階段。第三節(jié)動物細胞工程動物細胞工程是由多個學科綜合組成的新興技術。相關學科：基礎生物學、生物化學、遺傳學、免疫學、分子生物學、微生物學、化學工程學、應用物理、電子計算機等第三節(jié)動物細胞工程動物細胞工程的應用：生產(chǎn)基因工程藥物、單克隆抗體、疫苗等。主要特點：以工業(yè)化為目的，應用動物細胞培養(yǎng)的基本原理，研究生物活細胞為主體的生物反應過程，解決動物細胞培養(yǎng)過程中帶有共性和特性的工程技術問題。動物細胞工程通常采用的技術手段

動物細胞融合所采用技術的理論基礎動物細胞培養(yǎng)單克隆抗體胚胎移植核移植細胞增殖全息胚學說第三節(jié)動物細胞工程培養(yǎng)條件：適宜的溫度、pH、溶解氧水平動物細胞培養(yǎng)技術是其他動物細胞工程技術的基礎（1）原代培養(yǎng)：以動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織為材料，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個細胞，然后配制成一定濃度的細胞懸浮液，放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）傳代培養(yǎng)：隨著細胞的生長和增殖，培養(yǎng)瓶中的細胞越來越多，需要定期地用胰蛋白酶使細胞從瓶壁上脫離下來，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。一、動物細胞培養(yǎng)動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細胞懸浮液胰蛋白酶10代細胞原代培養(yǎng)50代細胞傳代培養(yǎng)細胞株無限傳代細胞系單個細胞加培養(yǎng)液動物胚胎或幼齡動物的組織、器官胰蛋白酶剪碎單個細胞加培養(yǎng)液制成細胞懸浮液細胞株細胞系細胞增殖無限傳代去掉組織間蛋白動物細胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體細胞懸浮液10代細胞50代細胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細胞株細胞系注意界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；細胞株和細胞系多數(shù)組織細胞固定在表面生長和分裂。隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變動物細胞動物細胞原代培養(yǎng)分裂10次細胞株傳代培養(yǎng)分裂50次(細胞系)(細胞株)細胞系無限分裂遺傳物質(zhì)未發(fā)生改變遺傳物質(zhì)發(fā)生改變無限增殖有關動物細胞培養(yǎng)的幾個問題（1）動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？主要成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。獨特之處：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動物血清等（動物體細胞大都生活在液體的環(huán)境）

血清是一種很好的營養(yǎng)物質(zhì)，含有動物體細胞生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，并給動物創(chuàng)造了生活環(huán)境。

任何血清使用前必須經(jīng)過鑒定，只有無菌、無內(nèi)毒素、無溶血或低溶血、蛋白質(zhì)以及營養(yǎng)素達一定標準以上才能使用。

血清與血漿的主要區(qū)別是血清里不含纖維蛋白原。（2）為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？

因為這些組織或器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強。（3）為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？

成塊組織不利培養(yǎng)，分散了做成細胞懸浮液利于培養(yǎng)（4）動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？

不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體貼壁生長

大多數(shù)組織細胞不適應懸浮生長，必須在固定的表面生長和分裂。脫離下來

當表面相互接觸時就停止分裂增殖——接觸抑制

動物細胞培養(yǎng)技術的應用（1）生產(chǎn)蛋白質(zhì)生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。（2）獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮。（3）用于檢測有毒物質(zhì)（4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預防疾病提供理論依據(jù)培養(yǎng)結果獲得細胞或細胞分泌蛋白培養(yǎng)目的動物血清液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基性質(zhì)細胞的全能性原理動物細胞培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)比較項目細胞株、細胞系植物體分泌蛋白快速繁殖、培育無病毒植株葡萄糖蔗糖植物激素培養(yǎng)基特有成分細胞的增殖植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較二、動物細胞融合細胞A細胞B雜種細胞滅活的病毒物理法化學法仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒用滅活的病毒誘導動物細胞融合過程細胞核病毒顆粒細胞核動物細胞融合的意義（1）克服植物遠緣雜交不親和性。（2）擴大遺傳重組范圍、增加變異、創(chuàng)造新品種。（3）單克隆抗體的生產(chǎn)。誘導動物細胞融合的方法物理法：離心、振動、電刺激化學法：聚乙二醇（PEG）生物法：滅活的動物病毒（喪失感染活性）主要用于制備單克隆抗體獲得雜種植株用途物理、化學方法（同左）滅活的病毒物理（離心、振蕩、電刺激）化學（聚乙二醇）誘導方法使細胞分散后誘導細胞融合去除細胞壁后誘導原生質(zhì)體融合細胞融合的方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性、植物細胞全能性細胞融合的原理動物細胞融合植物體細胞雜交比較項目植物、動物細胞融合的比較動物細胞融合最重要的用途制備單克隆抗體抗原吞噬細胞T細胞B細胞增殖、分化效應B細胞T記憶細胞B記憶細胞抗體抗原殺滅結合增殖增殖、分化效應T細胞靶細胞接觸、激活溶酶體酶靶細胞解體死亡增殖淋巴因子增強免疫細胞作用再次進入長期以來，為了獲得抗體，采用的是把某種抗原反復注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需抗體的方法。用這種方法獲得的抗體，不僅產(chǎn)量低，而且抗體的特異性差，純度低，反應不夠靈敏。人們發(fā)現(xiàn)，在動物發(fā)生免疫反應的過程中，體內(nèi)的B細胞可以產(chǎn)生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每個B細胞只分泌一種化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個B細胞進行無性繁殖，即克隆。用單個B細胞進行克隆，得到的細胞群能夠分泌一種化學性質(zhì)單一、特異性強的抗體，這種抗體叫做單克隆抗體。（1）提出問題：從動物血清中分離抗體的方法產(chǎn)量低、特異性差、純度低、反應不夠靈敏單克隆抗體

（2）設計方案：由于每一個B淋巴細胞只分泌一種特異性抗體，利用單個B淋巴細胞進行無性繁殖，就可以產(chǎn)生單克隆抗體。

由于B淋巴細胞不能無限增殖，因此利用小鼠骨髓瘤細胞與之融合，就可達到目的。

單克隆抗體制備過程：

注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體（選擇性培養(yǎng)基）選擇性培養(yǎng)基：使親本細胞不能存活而雜種細胞可存活本過程利用了免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理選用小鼠骨髓瘤細胞與B細胞融合，這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領，因而可以獲得大量單克隆抗體。

細胞的同源性越近，融合形成的雜種細胞越易成活有無限增殖能力（失去凋亡機制，失去接觸抑制等）的細胞是腫瘤細胞，而具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細胞，稱為癌細胞。單克隆抗體的應用①在基礎理論研究中具有重要意義②在疾病診斷、治療和預防方面，具有特異性高、靈敏度高等優(yōu)越性。③生物導彈（作為載體，運載抗癌藥物，形成“生物導彈”治療腫瘤）

目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。資料小結兩個過程動物細胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導細胞融合的新方法－－滅活病毒一個新細胞－－雜交瘤細胞一個優(yōu)勢－－單克隆抗體特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢三、細胞核移植技術細胞核移植，就是將一個細胞核用顯微注射的方法放進另一個細胞里去。供體——胚胎的干細胞核；體細胞的核受體——多是動物的卵子用途——細胞核移植技術只要用于研究胚胎發(fā)育過程中細胞核和細胞質(zhì)的功能，以及二者的關系；探討有關遺傳、發(fā)育和細胞分化等方面的基本理論問題。多莉羊的培育過程細胞核移植卵細胞C母綿羊子宮Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細胞細胞質(zhì)細胞核細胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵細胞細胞拆合技術妊娠黑面綿羊去核卵細胞白面綿羊乳腺細胞核細胞核移植重組細胞電脈沖刺激早期胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多莉

采用此方法可以將兩個不同種、屬的動物優(yōu)點集中在一起，產(chǎn)生具有雙親優(yōu)點的可繁殖的雜種動物。

細胞核移植對動物優(yōu)良雜交種的無性繁殖具有重大意義。這一技術的成功與完善對于優(yōu)良家禽的無性繁殖和瀕臨絕跡的珍貴動物的傳種意義重大。克隆動物的研究意義1.用于生物學和醫(yī)學研究的實驗動物2.改良動物品種3.治療人類疾病4.保護瀕危動物四、動物的胚胎移植

解決某些妊娠時間長、每胎產(chǎn)子數(shù)量少的優(yōu)良種畜的繁殖速度問題。（1）激素促多排卵（2）體外受精（3）培育胚胎（4）胚胎激素處理（5）胚胎植入母體操作過程胚胎移植技術試管動物（嬰兒）培養(yǎng)過程：卵細胞精子體外受精受精卵胚胎新個體母體子宮內(nèi)孕育、產(chǎn)出①植物組織培養(yǎng)是植物細胞工程技術的基礎。②動物細胞培養(yǎng)是各種動物細胞工程技術的基礎。③為達到特定的目的，許多細胞工程技術往往需要同時運用。不同細胞工程技術間的關系作業(yè)1.什么是單克隆抗體？主要應用是什么？2.簡述動物細胞融合與植物細胞融合的異同。第四節(jié)微生物細胞工程微生物細胞工程：應用微生物細胞進行細胞水平的研究和生產(chǎn)，具體內(nèi)容包括各種微生物細胞的培養(yǎng)、遺傳性狀的改變、微生物細胞的直接利用或獲得細胞代謝產(chǎn)物等。一、微生物原生質(zhì)體融合用水解酶除去微生物細胞壁，獲得原生質(zhì)體，然后用物理、化學或生物學方法，誘導遺傳特性不同的兩個親本原生質(zhì)體形成一個細胞，經(jīng)染色體交換、重組而達到雜交的目的，經(jīng)篩選獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子，這個過程就稱為微生物原生質(zhì)體融合。微生物原生質(zhì)體融合原核細胞的原生質(zhì)體融合真菌的原生質(zhì)體融合（一）微生物原生質(zhì)體融合的優(yōu)勢（1）大幅度提高親本之間的重組頻率細胞壁是微生物細胞之間物質(zhì)、能量和信息交流的主要屏障，同時也阻礙了細胞遺傳物質(zhì)的交換和重組，而原生質(zhì)體剝離了細胞壁，去除了細胞間物質(zhì)交換的主要障礙。融合過程中促融合劑的誘導作用，重組頻率顯著提高。（一）微生物原生質(zhì)體融合的優(yōu)勢（2）擴大重組的親本范圍常規(guī)雜交的親本間必須有感受態(tài)，而有的菌株由于其表面結構緣故而無法用常規(guī)雜交方法實現(xiàn)重組。原生質(zhì)體由于完全或部分失去了細胞壁，因此可以實現(xiàn)種間、屬間甚至門間的遠緣雜交。（一）微生物原生質(zhì)體融合的優(yōu)勢（3）遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移和重組性狀較多，集中雙親本優(yōu)良性狀的機會更大原生質(zhì)體融合時親本整套染色體參與交換。原生質(zhì)體融合時還同時傳遞了細胞質(zhì)。除進行雙親融合外，還能進行多親融合。（二）微生物原生質(zhì)體融合的基本步驟（1）親本及遺傳標記的選擇原生質(zhì)體親本的選擇應采用具有較大遺傳差異的近親菌株，重組后的新個體具有更大的雜種優(yōu)勢。遺傳標記：應帶有遺傳標記，便于重組體的檢出。應根據(jù)不同的實驗目的，選擇遺傳標記。營養(yǎng)缺陷和抗性標記用于遺傳分析；熱致死（50℃2h或60℃5min）用于大規(guī)模生產(chǎn)育種；孢子顏色是新技術，熒光染色；菌落形態(tài)。（2）原生質(zhì)體制備酶法分離原生質(zhì)體的影響因素培養(yǎng)基組成菌體培養(yǎng)方式菌體菌齡穩(wěn)定劑酶解前的預處理酶系和酶的濃度酶的作用溫度和pH菌體密度酶解方式（3）原生質(zhì)體再生

定義:

原生質(zhì)體在穩(wěn)定的再生培養(yǎng)基上，重新形成細胞壁，恢復至完整細胞形態(tài)，進一步生長、分裂和增殖，這一過程就是原生質(zhì)體再生。（3）原生質(zhì)體再生

定義:

原生質(zhì)體在穩(wěn)定的再生培養(yǎng)基上，重新形成細胞壁，恢復至完整細胞形態(tài)，進一步生長、分裂和增殖，這一過程就是原生質(zhì)體再生。影響再生的因素①菌體生理狀態(tài)年輕細胞比年老的細胞容易再生，菌絲頂端比老菌絲容易再生。②穩(wěn)定劑高滲溶液③酶濃度和