2012《醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)》設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)

PAGE4-設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)報(bào)告實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：動物細(xì)胞融合細(xì)胞核的分離與鑒定小組成員：班級：醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)報(bào)告姓名班級學(xué)號評分實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：動物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞融合，即在自然條件下或人工方法（生物的、物理的、化學(xué)的），是兩個或兩個以上的細(xì)胞合并形成一個細(xì)胞的過程。有性繁殖時發(fā)生的精、卵細(xì)胞結(jié)合是正常的細(xì)胞融合。誘導(dǎo)融合的方法很的，常用的主要有生物法（滅活的仙臺病毒）、化學(xué)法（聚乙二醇）、物理法（電泳）。滅活的仙臺病毒的磷脂外衣與動物細(xì)胞的膜十分相似，且病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。PEG是一種去垢劑，能破壞互相的接觸的磷脂雙分子層，從而是相互接觸的細(xì)胞膜之間的融合，形成一個雙核或多核的細(xì)胞。目前用得最廣泛的是聚乙二醇，因?yàn)樗椎?、簡便、且融合效果穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)步驟：（1）50%PEG夜的制備稱取一定量的PEG（Mv=4000）放入燒杯中，沸水浴加熱，使之溶化，待冷卻至0℃時，加入等體積預(yù)熱至50℃的無血清1640液混勻，置于37℃中保溫備用。（3）大白鼠細(xì)胞的制備左手抓老鼠，將大白鼠頭部向下，右手持尖頭鑷子輕輕插入眼眶中，然后將眼球向外拉出。①將流出的血置于事先盛有Alever溶液的燒杯中制成1：4的懸液。②取1ml的懸液加入4ml的生理鹽水，混勻平穩(wěn)之后，800r/min離心3min,棄去上清液，再按上述條件離心2次。③最后棄去上清液加hanks液4ml離心1次，再棄去上清液后，將離心管倒置于濾紙上，盡量流盡剩余液體（液體殘余會改變PEG濃度）（4）誘導(dǎo)與溫育用手指輕彈離心管底壁，是沉淀物松散，然后吸取50%的PEG0.5ml,在37攝氏度水浴中，緩慢逐滴加入離心管中（90s以內(nèi)），邊加邊搖動離心管，使之與細(xì)胞混合均勻，然后加入8-10ml左右hanks液輕輕吹打（防止融合的細(xì)胞分開）混勻，放入37℃水浴箱中靜置5min（以稀釋PEG），之后離心棄去上清液，加hanks液5ml離心1次，棄上清液，之后加入含小牛血清的1640培養(yǎng)液，在37℃的水浴中培養(yǎng)30分鐘。（5）染色觀察分別于溫浴5min、10min、20min、30min的時段取細(xì)胞懸液一滴制成臨時裝片，以0.2%次甲基蘭染液染色三分鐘后，蓋上蓋玻片，放在顯微鏡下進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分為五個階段：兩個細(xì)胞的細(xì)胞膜之間相互接觸粘連相接觸的兩細(xì)胞膜破口粘合。形成細(xì)胞膜通道兩細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)相通，形成細(xì)胞質(zhì)通道通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體細(xì)胞核并完成，形成一個含有兩個或多個核的圓形細(xì)胞均能在不同時間的臨時裝片上看到預(yù)期結(jié)果：在顯微鏡下可看見有2個或2個以上的大白鼠細(xì)胞膜融合在一起，形成1個異核體細(xì)胞。細(xì)胞融合率的計(jì)算：融合率是指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞，其細(xì)胞核的總數(shù)與此視野內(nèi)所有細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)之比。通常用百分?jǐn)?shù)來表示，且進(jìn)行多個視野測定，求平均值，在統(tǒng)計(jì)較為準(zhǔn)確。計(jì)算公式：融合率=×100%注意事項(xiàng)：1、pH為8.0-8.2是影響細(xì)胞融合與否的關(guān)鍵因素之一2、制備50%PEG保溫在37-39℃水浴中，不然冷卻后晶體析出，且細(xì)胞融合對溫度很敏感。3、為觀察細(xì)胞融合的形態(tài)需對細(xì)胞進(jìn)行染色除詹姆斯綠外還可用HE染色。4、在離心管中加入PEG前，一定要將離心管倒置于濾紙上，流盡剩余液體，否則殘留液會改變PEG液的濃度。5、PEG的處理時間:處理時間越長，融合效果越好,但對細(xì)胞的毒害也就越大。故一般將處理時間限制在1分鐘之內(nèi)。教師：日期：實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備、器具表實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：動物細(xì)胞融合表1—1實(shí)驗(yàn)儀器表名稱規(guī)格、型號數(shù)量說明顯微鏡1觀察尖頭鑷子1夾取、染色等水浴箱1恒溫處理離心機(jī)1離心載玻片/蓋玻片4制作裝片10ml離心試管10裝待離心液10ml量筒2量取試劑大燒杯1盛裝廢棄液體實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：動物細(xì)胞融合表1—2實(shí)驗(yàn)材料和試劑表名稱規(guī)格用量說明大鼠1聚乙二醇Mv=4000誘導(dǎo)劑hanks液緩沖液，等滲液0.2%次甲基蘭染液染色劑RPNI1640培養(yǎng)液10%滅活小牛血清和無血清兩種營養(yǎng)液Alever溶液抗凝暫時保持細(xì)胞完整醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)報(bào)告姓名班級學(xué)號評分實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：細(xì)胞核的分離與鑒定實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞核：它是由核膜（nuclearmembrane）、核骨架（nuclearscaffold）、核仁(nucleolus)幾部分組成。細(xì)胞核的主要構(gòu)造為核膜，是一種將細(xì)胞核完全包覆的雙層膜，可使膜內(nèi)物質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)、以及具有細(xì)胞骨架功能的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)核纖層分隔開來，其上特殊物質(zhì)可被染色劑染色顯現(xiàn)出顏色。核體的制備:核體是指含有少量細(xì)胞質(zhì)并由質(zhì)膜包裹的細(xì)胞核。分離細(xì)胞核的可用方法有吸出法、原生質(zhì)體破裂法、差速離心法排和排除法。差速離心法是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)的比重和大小不同，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速率不同從而將細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)分級分離出來。本實(shí)驗(yàn)就采用差速離心法。細(xì)胞核的鑒定，甲苯胺藍(lán)可使細(xì)胞核呈藍(lán)紫色實(shí)驗(yàn)步驟：（1）、斷頭法處死小白鼠，手提尾部使腹內(nèi)血液盡量流出，迅速解開其腹腔取出肝臟，去出結(jié)締組織，剪成小塊，盡快置于盛有0.9%NaCl的燒杯中。反復(fù)洗滌盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。（2）、將濕重為1g的肝組織放入燒杯中，用量筒取8ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于燒杯中，盡量剪碎肝組織后全部加入。（3）、將剪碎的肝組織導(dǎo)入勻漿管中，使勻漿器下端侵入盛有冰塊的器血中，左手持，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動研磨多次，直至看不到明顯組織塊。用8層紗布過濾于勻漿管中，然后制備一張涂片①，自然干燥。（4）、將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機(jī)以2500r/min離心15min,棄去上清液，大約剩余1ml上清液，然后取上清液制備一張涂片①，自然干燥。將殘留液體用氣管吹成懸液，滴一滴于干凈的載蓋玻片上，制成涂片②，自然干燥。（5）、固定，將制備好的涂片放入70%的乙醇中固定5min,晾干。（6）、染色，分別在涂片①②上滴加1%甲苯胺藍(lán)染色液，染色5-7min（7）、流水沖去染液，晾干（8）、鏡檢顯微鏡下觀察并分析注意事項(xiàng)：（1）、在染色時時間一定要足夠，否則染色不完全會得到不理想的結(jié)果。（2）、去掉胞質(zhì)的核體貼附能力弱，應(yīng)注意在用固定、染色時盡量避免胞核的脫落。預(yù)期結(jié)果：在低倍鏡下找到標(biāo)本，再換高倍鏡，可以觀察到經(jīng).1%甲苯胺藍(lán)染液染色的小白鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞核已經(jīng)游離出來，被染成藍(lán)紫色，圓形，即細(xì)胞核。教師：日期：實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備、器具表實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：動物細(xì)胞細(xì)胞核的分離與鑒定表2—1實(shí)驗(yàn)儀器表名稱規(guī)格