蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展一、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用人類基因組計(jì)劃（HGP）1986年，達(dá)爾貝科提出人類基因組計(jì)劃1990年，美國國會(huì)批準(zhǔn)“HGP”，9月，中國獲準(zhǔn)加入，負(fù)責(zé)測定人類基因組序列的1%2000年6月26日，草圖繪制成功2003年4月14日，人類基因組序列圖繪制成功蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)生的背景改變花色的轉(zhuǎn)基因矮牽牛花轉(zhuǎn)入熒光素酶蛋白基因的發(fā)熒光煙草藍(lán)色玫瑰蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展歷史1994年，澳大利亞科學(xué)家Wilkins等人首次提出蛋白質(zhì)組概念1996年，澳大利亞建立了第1個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心（APAF）2001年4月，美國成立了國際人類蛋白質(zhì)組研究組織（HUPO）20世紀(jì)90年代中期，蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式為研究對(duì)象各國政府支持，國際著名研究和商業(yè)機(jī)構(gòu)加盟：美國國家癌癥研究院（NationalCancerInstitute）和食品藥品監(jiān)督管理局（FoodandDrugAdministration）共同投資數(shù)百萬美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。Celera公司投資上億美元獨(dú)自啟動(dòng)了全面鑒定和分類匯總?cè)祟惤M織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫的工作。我國也于1998年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì)2003成立了中國人類蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO），并分別于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召開了中國蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，2004年10月在中國北京召開了第三屆國際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議?？萍疾恳褜⒓膊〉鞍踪|(zhì)組研究列入我國“973”計(jì)劃項(xiàng)目和“863”計(jì)劃項(xiàng)目；國家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。2003年12月15日，國際人類蛋白質(zhì)組組織負(fù)責(zé)人在北京宣布，國際人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃正式啟動(dòng)，“人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃”和“人類血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃”兩大項(xiàng)目首先開始執(zhí)行，其中“人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃”由中國科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)執(zhí)行，這是我國科學(xué)家第一次領(lǐng)導(dǎo)執(zhí)行重大國際科技協(xié)作計(jì)劃。

首次由我國科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的國際重大科研合作項(xiàng)目——人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃，被宣告取得階段性新進(jìn)展。幾年來圍繞人類肝臟蛋白質(zhì)組的表達(dá)譜、修飾譜及其相互作用的連鎖圖等九大科研任務(wù)，我國科學(xué)家已經(jīng)成功測定出6788個(gè)高可信度的中國成人肝臟蛋白質(zhì)，系統(tǒng)構(gòu)建了國際上第一張人類器官蛋白質(zhì)組“藍(lán)圖”；發(fā)現(xiàn)了包含1000余個(gè)“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖；建立了2000余株蛋白質(zhì)抗體。蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展一、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個(gè)詞的雜合,意指proteinsexpressedbyagenome，即“一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”。

蛋白質(zhì)組學(xué)的概念對(duì)應(yīng)于基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同。在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。蛋白質(zhì)組是：蛋白質(zhì)組學(xué)是什么樣的一門科學(xué)？

指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。

主要研究內(nèi)容了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類；明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類似于電路的網(wǎng)絡(luò)的；描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，如與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位。蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展一、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展二、蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)概念三、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤研究中的應(yīng)用蛋白質(zhì)組研究更為復(fù)雜和困難：蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過基因數(shù)目蛋白質(zhì)隨時(shí)間和空間而變化當(dāng)前主要任務(wù)：發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)研究蛋白質(zhì)組的組成成分

支撐技術(shù)主要有雙向凝膠電泳、以質(zhì)譜為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)及生物信息學(xué)分析。

蛋白質(zhì)組表達(dá)模式（expressionprofile）：蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)（一）蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備

通?？刹捎眉?xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成不同部分，分別進(jìn)行研究。樣品預(yù)分級(jí)的主要方法蛋白質(zhì)溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質(zhì)定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質(zhì)細(xì)胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等樣品預(yù)分級(jí)主要作用在于提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測靈敏度。組織水平上的蛋白質(zhì)組樣品制備臨床樣本都是由多種細(xì)胞或組織混合而成，如腫瘤中癌變上皮細(xì)胞總是與血管、間質(zhì)細(xì)胞等混雜一起。

激光捕獲顯微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特定的細(xì)胞或細(xì)胞群。

LCM具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)快速簡單、有效減少交叉污染。樣品的切割與分離由激光一步完成，并可以保持被分離的樣品的完整性。結(jié)合免疫熒光能夠基于組織細(xì)胞的表型和功能特征進(jìn)行分離樣品組分。對(duì)制樣的要求靈活多樣，使用范圍較廣。通過LCM對(duì)組織切片進(jìn)行切割與分離可以分離收集從形態(tài)上（普通染色），表型或功能上（熒光染色）可以辨認(rèn)均一性的細(xì)胞群體，從而克服了組織不均一的特點(diǎn)，提高了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，這在腫瘤生物學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)（二）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離雙向凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量，結(jié)合凝膠化學(xué)特性，分離各種蛋白質(zhì)的方法。原理第1向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，具有相同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)無論其分子大小，在電場的作用下都會(huì)用聚焦在某一特定位置即等電點(diǎn)處；第2向則按分子量的不同用SDS分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。第一向分離等電聚焦蛋白質(zhì)是兩性分子，在不同的pH環(huán)境中可以帶正電荷、負(fù)電荷或不帶電荷。對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)來說都有一個(gè)特定的pH，此時(shí)蛋白質(zhì)的靜電荷為零，此pH值即該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)。將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時(shí)，它會(huì)向與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。在移動(dòng)過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并且隨著移動(dòng)的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)pH位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動(dòng)。聚焦是一個(gè)與pH相關(guān)的平衡過程：蛋白質(zhì)以不同的速率靠近并最終停留在它們各自的pI值；在等電聚焦過程中，蛋白質(zhì)可以從各個(gè)方向移動(dòng)到它的恒定位點(diǎn)。第二向分離SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳雙向電泳的第二向是將IPG膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白轉(zhuǎn)移到第二向SDS．PAGE凝膠上，根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量或分子量(MW)大小與第一相垂直的分離。蛋白質(zhì)與十二烷基硫酸鈉(SDS)結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)．SDS復(fù)合物，由于SDS是一種強(qiáng)陰離子去垢劑．所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，能消除不同分子之間原有的電荷差異，從而使得凝膠中電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響．而主要取決于蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量大小，其遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，在蛋白質(zhì)組研究中。需要在同樣的條件下同時(shí)走多塊膠，這對(duì)凝膠與凝膠之間的比較十分重要。特點(diǎn)可分離10～100kD分子量的蛋白質(zhì)高靈敏度和高分辨率便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理與質(zhì)譜分析匹配雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)的缺點(diǎn)極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。

膠內(nèi)酶解過程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。新型非凝膠技術(shù)

液相色譜法

liquidchromatography，LC毛細(xì)管電泳法

capillaryelectrophoresis，CE液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LPLC-MS/MS）

蛋白質(zhì)混合物直接通過液相色譜分離以代替2-DE的分離，然后進(jìn)入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過串聯(lián)MS技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒定蛋白質(zhì)。

根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性及疏水性不同，用MS分離多肽復(fù)合物。離子交換色譜是通過溶質(zhì)在離子交換色譜固定相上具有不同的保留能力，而實(shí)現(xiàn)樣品分離的色譜技術(shù)，而反相液相色譜是基于溶質(zhì)疏水性的差異而實(shí)現(xiàn)分離的色譜技術(shù)。通過這兩種色譜模式的聯(lián)用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜生物樣品的二維分離。

多維色譜技術(shù)（LC/LC-MS/MS）

多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multidimensionalproteinidentificationtechnology)將不同分離模式的色譜柱以串聯(lián)方式合并于同一根色譜柱中進(jìn)行，在同一根色譜柱的前半部分裝填強(qiáng)陽離子色譜填料，后部分裝填反相液相色譜填料，該方法可對(duì)樣品量較少的蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)（三）蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定傳統(tǒng)方法：Edman降解法:Edman降解（Edmandegradation）：是測定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，主要是從蛋白質(zhì)或多肽氨基末端進(jìn)行分析。由埃德曼（P．Edman）在上世紀(jì)50年代所創(chuàng)立。分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個(gè)步驟。首先在pH9.0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白質(zhì)或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)處理耦合后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的N一端第一個(gè)肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物并在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色譜法鑒定出降解下來的PTH-氨基酸種類，從而得到蛋白質(zhì)或多肽N端序列信息。Edman降解法的優(yōu)點(diǎn)是異硫氰酸苯酯與所有氨基酸殘基的反應(yīng)產(chǎn)率和回收率都相當(dāng)高，因此反應(yīng)副產(chǎn)物少，用色譜可以準(zhǔn)確鑒定。蛋白質(zhì)序列分析鑒定蛋白質(zhì)

一些傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析技術(shù)如蛋白質(zhì)序列分析技術(shù)（Edman降解法,1950），仍然可用于當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究。其缺點(diǎn)是難于實(shí)現(xiàn)高通量，同時(shí)對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的鑒定上其靈敏度難于達(dá)到要求。

A-R-G-F-L-E-K-L

(得到部分序列)491蛋白質(zhì)微量序列儀印漬轉(zhuǎn)移酶解提取肽混合物毛細(xì)管HPLC儀收集肽于PVDF膜

PVDF膜通過Edman降解對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線

雙向電泳分離新型蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)

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質(zhì)譜（MS）法基本原理：質(zhì)譜法(MassSpectrometry,MS)即用電場和磁場將運(yùn)動(dòng)的離子（帶電荷的原子、分子或分子碎片，有分子離子、同位素離子、碎片離子、重排離子、多電荷離子、亞穩(wěn)離子、負(fù)離子和離子－分子相互作用產(chǎn)生的離子）按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測的方法。測出離子準(zhǔn)確質(zhì)量即可確定離子的化合物組成。樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。

MAIDI-TOFESI-MS/MS

酶解脫鹽濃縮飛行時(shí)間質(zhì)譜儀電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀毛細(xì)管HPLC儀點(diǎn)樣板序列標(biāo)簽(PST)數(shù)據(jù)庫搜索雙向電泳分離

蛋白質(zhì)鑒定通過質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線

肽肽質(zhì)指紋（PMF）質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)路線圖基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）MALDI-TOF質(zhì)譜儀：靈敏度高（可達(dá)fmol），分析速度快，譜圖簡單易于解析以及受緩沖液、鹽份的干擾小電噴霧質(zhì)譜（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）電噴霧質(zhì)譜儀：靈敏度高,能與液相色譜、毛細(xì)管電泳等高效分離手段聯(lián)用主要質(zhì)譜類型鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線

基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜通過肽質(zhì)譜指紋圖（peptidemassfingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配

電噴霧質(zhì)譜通過測出樣品中部分肽段二級(jí)質(zhì)譜信息或氨基酸序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配

聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì)

組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù)兩級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（FTMS）表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）

蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)（四）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)應(yīng)用

1、對(duì)雙向電泳結(jié)果進(jìn)行圖像分析，識(shí)別差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；構(gòu)建雙向凝膠電泳圖譜。2、單獨(dú)或綜合運(yùn)用質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)、氨基酸測序結(jié)果等查詢數(shù)據(jù)庫以鑒定蛋白質(zhì)。3、構(gòu)建蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。（http://www.expasy.ch/）目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NRDB和dbEST數(shù)據(jù)庫。NRDB是由NCBI創(chuàng)建的，是NCBI的BLAST搜索程序的默認(rèn)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫由GenPept（由GenBank編碼序列自動(dòng)翻譯而成數(shù)據(jù)庫）、SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫、SPupdate（每周更新的SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫）、PIR（蛋白質(zhì)信息資源）和GenPeptUpdate(每天更新的GenPept)數(shù)據(jù)庫復(fù)合而成。因此該數(shù)據(jù)