常用細胞培養(yǎng)技術 傳代1原代培養(yǎng)細胞的首次傳代

2023/10/271原代培養(yǎng)細胞首次傳代

2023/10/2722023/10/27一、原代培養(yǎng)細胞的首次傳代懸浮細胞：增殖，數量增加甚至達飽和密度；貼壁細胞：相互匯合，覆蓋整個瓶底；=〉細胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進行分瓶培養(yǎng)使細胞分散接種的過程稱之為傳代。傳代原因：1、細胞與培養(yǎng)基的接觸面減少，造成營養(yǎng)不足；2、生長的密度抑制。2023/10/2732023/10/2742023/10/27貼壁細胞的消化傳代步驟(1)吸除舊培養(yǎng)基(2)加2mLPBS（無鈣、鎂），漂洗一次(3)加1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）(4)輕搖培養(yǎng)瓶，消化液鋪滿細胞表面2023/10/2752023/10/27(4)

鏡下見細胞回縮，細胞間隙增大，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2～3分鐘。(5)鏡下見變圓，立即終止消化。(6)加完全培養(yǎng)基，反復吹打；吹打按順序進行，確保所有瓶壁均吹到吹打要輕柔，不要出現泡沫，避免機械損傷(7)

計數，調整濃度，分瓶培養(yǎng)。2023/10/2762023/10/27首次傳代應注意以下幾點：(1)密度不高，不能傳代，〉80%(2)控制消化時間。多種細胞混雜，不同細胞消化時間不同。(3)吹打輕，減少機械損傷。(4)接種量多一些，使盡快適應環(huán)境，生長和繁殖。(5)pH應偏低些，血清濃度加大至15%～20%。2023/10/2772023/10/27125二、細胞系的維持細胞系的維持通過換液、傳代、再換液、再傳代和細胞凍存實現。細胞系的維持要注意以下幾點：每個細胞系做好檔案，包括組織來源、生物學特性、培養(yǎng)特點（培養(yǎng)液、換液、傳代時間……)、生長形態(tài)、遺傳學特點……。換液、傳代按自身規(guī)律進行。防止細胞系間交叉污染。細胞系傳代次數較少時，做好充足凍存貯備。做好細胞系（或株）的鑒定和管理工作。2023/10/2782023/10/2792023/10/27三、原代細胞的純化和克隆原代細胞絕大多數混合生長為了保證實驗結果的可靠性、一致性、穩(wěn)定性和可重復性；采用單一種類細胞實驗；因而純化就成為實驗研究的重要一步。2023/10/27102023/10/27純化方法(一)自然純化：傳代過程中自然淘汰法生長優(yōu)勢旺排擠生長慢的細胞最后留下優(yōu)勢旺細胞。如腫瘤突變細胞通過此方法建立細胞系。缺點：耗時長；最后剩下的不一定是所需細胞，通常是成纖維細胞，少部分是惡性腫瘤細胞。(二)人工純化：利用人為手段造成有利某一細胞生長環(huán)境，抑制其他細胞生長。主要有以下5種方法：2023/10/27112023/10/271.培養(yǎng)基限定法：細胞生長過程中，必須存在或去除某種物質，否則無法生長，而其他細胞與之相反。例如加入特殊的細胞因子而純化出只依賴于這種細胞因子生長的細胞系。2.酶消化法：上皮細胞對胰蛋白酶的耐受性高；成纖維細胞對胰蛋白酶的敏感---耐受性低；使兩者分開，達到純化的目的。2023/10/27122023/10/273.機械刮除法原代培養(yǎng)時，上皮細胞和成纖維細胞為分區(qū)成片生長，機械方法去除不需要的細胞區(qū)域而保留需要的細胞區(qū)域。方法：顯微鏡下，用專用細胞刮刮掉，沖洗2次后，繼續(xù)培養(yǎng)。多次后達純化目的。2023/10/27132023/10/274.反復貼壁法成纖維細胞：貼壁快（10-30min）；上皮細胞：短時間不能附著或附著不穩(wěn)定，稍振蕩即浮起據此純化細胞。方法：鏡下觀察，部分細胞貼壁后搖蕩培養(yǎng)基，倒掉反復多次，達到去除上皮細胞的目的。2023/10/27142023/10/275.克隆法稀釋細胞，使單個細胞在體外增殖6代以上，形成的細胞群稱作克隆。每個克隆含50個以上細胞，一個克隆起源一個細胞，達到純化目的。使細胞遺傳學和生物學特性更相似，利于實驗研究。6.流式細胞儀分離法可根據細胞物質含量、結構和大小等達到分離細胞的目的。

2023/10/27152023/10/27細胞傳代方法傳代細胞，不同細胞采取不同的傳代方法。貼壁生長的細胞：消化法傳代；部分貼壁的細胞：直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞：加入等量新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散傳代自然沉降，加入新培養(yǎng)基后再吹打分散傳代。2023/10/27162023/10/27貼壁細胞的消化傳代步驟(1)吸除舊培養(yǎng)基(2)加2mLPBS（無鈣、鎂），漂洗一次(3)加1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）(4)輕搖培養(yǎng)瓶，消化液鋪滿細胞表面2023/10/27172023/10/27(4)

鏡下見細胞回縮，