分析化學(xué)課件：第十四章 平面色譜法

第十四章平面色譜法分析化學(xué)(下第三版)一、概述二、平面色譜技術(shù)參數(shù)三、平面色譜固定相與制備四、樣品的制備與點(diǎn)樣五、平面色譜的展開(kāi)六、展開(kāi)后處理與斑點(diǎn)定位七、定性分析方法八、紙色譜法簡(jiǎn)介九、平面色譜法的特點(diǎn)及應(yīng)用主要內(nèi)容第一節(jié)概述平面色譜法(planechromatography)是在平面上進(jìn)行分離的一種色譜方法；主要包括薄層色譜法、紙色譜法和薄層電泳法。一般過(guò)程：

鋪板→活化→點(diǎn)樣→展開(kāi)→定位(定性)/洗脫(定量)

平面色譜的分類及分離機(jī)理紙色譜法（PC,paperchromatography）：屬分配色譜薄層色譜法(TLC,thinlayerchromatography)：吸附薄層、分配薄層、離子交換薄層、凝膠薄層薄層色譜法：經(jīng)典薄層、高效薄層(HPTLC)、高壓薄層(OPTLC)薄層電泳法(thinlayerelectrophoresis,了解)：主要用于生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸、多肽、糖類）等帶電荷的物質(zhì)。第二節(jié)平面色譜的主要技術(shù)參數(shù)一、定性參數(shù)二、相平衡參數(shù)三、面效參數(shù)四、分離參數(shù)一、定性參數(shù)(qualityparameters)1.比移值Rf(Retentionfactor)續(xù)前討論

Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開(kāi)劑的性質(zhì)有關(guān)。

色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜基本定性參數(shù)，說(shuō)明組分的色譜保留行為續(xù)前1）Rf范圍：0<Rf<1

（組分遷移速度和距離小于展開(kāi)劑遷移速度和距離）

Rf=0.2——0.8（常用）

0.3——0.5（最佳）2)影響Rf的因素:被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),薄層板的性質(zhì),展開(kāi)劑的性質(zhì),溫度,展開(kāi)劑蒸汽等續(xù)前2.相對(duì)比移值Rs(了解)討論參考物與被測(cè)組分在完全相同條件下展開(kāi)可以消除系統(tǒng)誤差，大大提高重現(xiàn)性和可靠性；參考物可以是后加入純物質(zhì)，也可是樣品中已知組分相對(duì)比移值Rs與組分、參考物性質(zhì)及色譜條件有關(guān)，范圍可以大于或小于1二、相平衡參數(shù)相平衡參數(shù)：分配系數(shù)K和容量因子kR’表示單位時(shí)間內(nèi)一個(gè)分子在流動(dòng)相中出現(xiàn)的幾率，也可以表示組分分子在平面上移動(dòng)的速度.Rf＝L/L0=ut/u0t，定時(shí)展開(kāi)時(shí)R’＝Rf討論

⑴

Rf與K有關(guān)，即與組分性質(zhì)（溶解度）以及薄層板和展開(kāi)劑的性質(zhì)有關(guān)，K↑大，Rf↓?、票影逡欢ǎ琑f只與組分性質(zhì)有關(guān)，對(duì)于極性組分，

展開(kāi)劑極性↑大，Rf↑大（容易洗脫）展開(kāi)劑極性↓小，Rf↓?。ú蝗菀紫疵摚?/p>

⑶Rf＝1K或k=0組分在前沿

Rf＝0K或k=∞組分在原點(diǎn)（三）面效參數(shù)1、理論塔板數(shù)

n=16(L/W)2L:原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離

W：組分斑點(diǎn)的縱向?qū)挾?、塔板高度

H=L0/nL0：原點(diǎn)到展開(kāi)劑前沿的距離

n越大，H越小。（四）分離參數(shù)1、分離度(resolution;R)兩相鄰斑點(diǎn)中心的距離與兩斑點(diǎn)平均寬度的比值

L1

、L2:分別為原點(diǎn)至兩半斑點(diǎn)中心的距離，W1、W2斑點(diǎn)的寬度。2.分離數(shù)(separationnumberSN，了解)定義：相鄰斑點(diǎn)分離度為1.177時(shí)，在Rf=0(原點(diǎn))到Rf=1(溶劑前沿)之間能容納的色譜斑點(diǎn)數(shù)。

一般薄層板的分離數(shù)為7~10，高效薄層板可達(dá)10~20。SN是衡量分離容量的重要參數(shù)第三節(jié)平面色譜固定相與制備一、平面色譜常用吸附劑(absorbent)：

多孔、微粒狀物質(zhì),吸附能力與吸附中心的多少及氫鍵形成能力的大小有關(guān)

1.硅膠

2.氧化鋁

3.聚酰胺1.硅膠（SiO2·H2O,silicagel）結(jié)構(gòu)：內(nèi)部——硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu)→多孔結(jié)構(gòu)表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心

特性：

1）與極性物質(zhì)或不飽和化合物形成氫鍵物質(zhì)極性↑，吸附能力↑→強(qiáng)極性吸附中心，不易洗脫吸附活性次序：活潑型>束縛型>游離型

2）吸水→失活→105～110OC烘干30分鐘(可逆失水)→吸附力最大→500OC烘干(不可逆失水)→活性喪失，無(wú)吸附力適用：分析酸性或中性物質(zhì)

續(xù)前2.氧化鋁堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)中性氧化鋁pH＞7.5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)3.聚酰胺氫鍵作用氫鍵能力↑強(qiáng)，組分比移值越小二、吸附劑的選擇原則

根據(jù)被測(cè)物極性和吸附劑的吸附能力被測(cè)物極性強(qiáng)——弱極性吸附劑被測(cè)物極性弱——強(qiáng)極性吸附劑三、薄層板的制備(preparationoftheplate)定性分析——窄條定量分析——10×20cm硅膠G——自含粘和劑硅膠H——不含粘和劑，鋪板時(shí)另加入CMC-Na硅膠GF254——含熒光劑，254nm紫外光照發(fā)綠光硅膠GF365——含熒光劑，365nm紫外光照發(fā)光第四節(jié)樣品制備與點(diǎn)樣一、點(diǎn)樣溶液的制備二、點(diǎn)樣方式與方法三、點(diǎn)樣工具一、點(diǎn)樣溶液的制備由于平面色譜一般為一次性使用，故樣品一般不需要復(fù)雜的前處理，應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題有：配制點(diǎn)樣溶液的溶劑對(duì)樣品的溶解度不宜過(guò)大，應(yīng)盡量為有機(jī)溶劑，避免使用水；根據(jù)方法的靈敏度，配制合適的供試品溶液的濃度（0.01%~1.00%），必要時(shí)應(yīng)進(jìn)行稀釋和濃縮；選擇合適的檢測(cè)方式，可根據(jù)檢測(cè)方法的不同，對(duì)樣品進(jìn)行必要的前處理，如衍生溶劑粘度不宜過(guò)高，且沸點(diǎn)適宜。二、點(diǎn)樣設(shè)備和點(diǎn)樣方式點(diǎn)狀點(diǎn)樣：是最為常用的點(diǎn)樣方式。定性分析可選用內(nèi)徑為0.5mm管口平整的毛細(xì)管或微量注射器點(diǎn)樣；定量分析可選用微量注射器或自動(dòng)的微量點(diǎn)樣裝置進(jìn)行。帶狀點(diǎn)樣：當(dāng)樣品溶液的體積大、濃度稀時(shí)，可采用自動(dòng)的點(diǎn)樣器進(jìn)行帶狀點(diǎn)樣，常用來(lái)進(jìn)行制備分離。適用于定量制備分析。自動(dòng)點(diǎn)樣（了解）：全自動(dòng)點(diǎn)樣裝置結(jié)合了現(xiàn)代最先進(jìn)的電子及機(jī)械技術(shù)，能進(jìn)行點(diǎn)狀點(diǎn)樣或帶狀點(diǎn)樣，采用計(jì)算機(jī)程序控制，靈活多用，定量結(jié)果精密準(zhǔn)確。特殊的點(diǎn)樣方式（了解）熱微量抽提法：將一些藥物進(jìn)行微量升華等熱微量分離轉(zhuǎn)移技術(shù)與薄層色譜法連用的方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是大大縮短了提取生藥中揮發(fā)性成分前處理的時(shí)間，簡(jiǎn)化了提取方法，減少了樣品用量，缺點(diǎn)是不宜用于非揮發(fā)性成分。此法亦可用于小量生藥的半定量分析，生藥成分的微量制備以及生藥的指紋鑒定等。流體提取法：物質(zhì)在超臨界流體中的溶解度由于壓縮氣體與溶質(zhì)分子間相互作用加強(qiáng)而大大增加。改變溫度和壓力就可改變超臨界流體的特性，因此可以分別在一定溫度和壓力條件下將不同極性的成分從樣品中提取出來(lái)，并與薄層連用。此法主要應(yīng)用于中藥有效成分分析。點(diǎn)狀點(diǎn)樣a=20mmb=15mmc=10mm條狀點(diǎn)樣a=20mmb=15mmc=10mmd=5mm點(diǎn)樣示意圖三、點(diǎn)樣工具（了解）第五節(jié)平面色譜的展開(kāi)一、展開(kāi)劑的選擇二、展開(kāi)方式三、展開(kāi)缸四、影響展開(kāi)的因素一、展開(kāi)劑的選擇選擇原則：在相似相容原則下，兼顧溶劑的純度、穩(wěn)定性、粘度、蒸汽壓以及毒性等性質(zhì)展開(kāi)劑中各組分的作用（了解）展開(kāi)劑中比例較大的溶劑極性相對(duì)較小，起溶解溶質(zhì)和基本分離的作用，一般稱為底劑。展開(kāi)劑中比例較小的溶劑，極性較大，對(duì)被分離物質(zhì)有較強(qiáng)的洗脫力，幫助化合物在薄層上移動(dòng)，可以增大比移值，但不能提高分辨率，可稱為極性調(diào)節(jié)劑。展開(kāi)劑中加入少量酸、堿，可抑制某些酸、堿性物質(zhì)或其鹽類的解離而產(chǎn)生斑點(diǎn)拖尾，稱為拖尾抑制劑。展開(kāi)劑中加入丙酮等中等極性溶劑，可促使不相混合的溶劑混溶，并可降低展開(kāi)劑的粘度，加快展速，助溶劑。二、展開(kāi)方式線性展開(kāi)上行展開(kāi)下行展開(kāi)雙向展開(kāi)近水平展開(kāi)環(huán)形展開(kāi)：適用于比移值較小的組分展開(kāi)多次展開(kāi)單向多次增量多次展開(kāi)階式展開(kāi)連續(xù)展開(kāi)分離－反應(yīng)－分離超壓薄層旋轉(zhuǎn)薄層上行展開(kāi)紙色譜下行展開(kāi)裝置不同種元胡多次展開(kāi)薄層色譜圖第一次展開(kāi)第二次展開(kāi)第三次展開(kāi)三、展開(kāi)缸展開(kāi)缸的底部必須平整，薄層板放入后能呈水平；展開(kāi)缸必須密閉，使展開(kāi)缸內(nèi)能被展開(kāi)劑蒸氣飽和且展開(kāi)劑組成不變，得到理想的分離及重現(xiàn)的結(jié)果。磨口蓋要嚴(yán)密，必要時(shí)可涂少量凡士林或甘油淀粉糊密封，但須防止污染薄層板及展開(kāi)劑。展開(kāi)缸薄層展開(kāi)缸常用方形及園形二種，方形者有不同尺寸及平底或夾心槽（雙槽）可供。圓形上端用鋼卡使玻璃蓋扣緊密封。雙槽展開(kāi)缸使用時(shí)先將展開(kāi)劑倒在槽的一側(cè)，將薄層板放入到另一側(cè)，密閉飽和一段時(shí)間后再將展開(kāi)缸傾斜，使展開(kāi)劑流入放有薄層板的一側(cè)，進(jìn)行展開(kāi)。雙槽展開(kāi)缸1、先將板斜放入無(wú)展開(kāi)劑的槽內(nèi)進(jìn)行飽和2、飽和10~15min后傾斜展開(kāi)缸，讓板浸入展開(kāi)劑中展開(kāi)圓形展開(kāi)缸四種飽和方式：A不飽和；B部分飽和；C有濾紙直接展開(kāi)法；D充分飽和ABCD四、影響展開(kāi)的因素1、相對(duì)濕度2、溶劑蒸氣3、溫度4、展開(kāi)方式5、展距6、展開(kāi)缸的放置影響展開(kāi)的因素1：相對(duì)濕度在吸附薄層中，特別是應(yīng)用親水性吸附劑，展開(kāi)的過(guò)程中，空氣的相對(duì)濕度以及展開(kāi)室中的水蒸汽必須嚴(yán)格控制，因?yàn)樗羝c吸附劑之間有很大的親和力，即使是微量的水蒸汽對(duì)色譜分離結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生較大影響。展開(kāi)時(shí)最佳相對(duì)濕度范圍決定于溶質(zhì)和溶劑的極性。薄層展開(kāi)時(shí)控制濕度應(yīng)注意的問(wèn)題（了解）記錄相對(duì)濕度：在色譜條件中除固定相、展開(kāi)劑等條件外，將認(rèn)為最佳分離條件時(shí)的相對(duì)濕度記錄下來(lái)，為以后工作提供參考。控制相對(duì)濕度硫酸溶液法無(wú)機(jī)鹽飽和溶液法薄層展開(kāi)時(shí)控制濕度應(yīng)注意的問(wèn)題硫酸溶液控制濕度方法表影響展開(kāi)的因素2：溶劑蒸氣平面色譜分離過(guò)程是在兩相未充分平衡的狀態(tài)下進(jìn)行的，與柱色譜不同，氣相也參與了展開(kāi)過(guò)程，因此薄層的展開(kāi)過(guò)程比較復(fù)雜。也因此產(chǎn)生了一些現(xiàn)象如邊緣效應(yīng)、雙展開(kāi)前沿等。常規(guī)的平底展開(kāi)室一般是用展開(kāi)劑浸濕的濾紙貼在展開(kāi)室內(nèi)壁，如果需要可用小燒杯盛與展開(kāi)劑不同的揮發(fā)性酸、堿進(jìn)行飽和或預(yù)平衡。另展開(kāi)時(shí)，應(yīng)注意展開(kāi)室的密閉。影響展開(kāi)的因素3：溫度展開(kāi)時(shí)環(huán)境的溫度對(duì)紙色譜的影響較大，一方面是由于紙色譜展開(kāi)時(shí)間較長(zhǎng)，另一方面因?yàn)榧埳V屬于分配色譜，組分的分配系數(shù)受溫度的影響比較明顯，因此在進(jìn)行紙色譜的展開(kāi)時(shí)應(yīng)注意保持恒定的溫度。溫度對(duì)薄層色譜的影響較紙色譜小，在吸附色譜上，溫度從20度變到4度即不影響展開(kāi)時(shí)間，也不影響比移值，除了特殊要求，薄層色譜可在室溫下進(jìn)行。影響展開(kāi)的因素4：展開(kāi)方式不同的展開(kāi)方式，不同的展開(kāi)條件對(duì)平面色譜的分離效果有明顯的影響。應(yīng)根據(jù)樣品的理化性質(zhì)及分析要求選擇合適的展開(kāi)方式。影響展開(kāi)的因素5：展距一般紙色譜的展距為20～30cm,常規(guī)薄層展距未10～20cm，高效薄層展距為5～10cm，在這種展距內(nèi)得不到分離得組分，增加展距并非是解決問(wèn)題得方法，因?yàn)榉蛛x度僅正比于展距得平方根，延長(zhǎng)展距不僅延長(zhǎng)了時(shí)間，而且會(huì)引起斑點(diǎn)擴(kuò)散降低分離度?？梢酝ㄟ^(guò)改變展開(kāi)方式或優(yōu)化展開(kāi)劑，以得到理想的分離結(jié)果。影響展開(kāi)的因素6：展開(kāi)室的放置展開(kāi)室應(yīng)放在水平、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，不能有陽(yáng)光直射，也不能在通風(fēng)處放置，離開(kāi)熱源，避免溫度波動(dòng)對(duì)分離不利，光敏物質(zhì)的分離應(yīng)將展開(kāi)室置于暗處。第六節(jié)展開(kāi)后處理與檢視一、展開(kāi)后處理二、斑點(diǎn)檢視

1、光學(xué)檢視

2、蒸氣檢視

3、試劑顯色

4、生物自顯影一、展開(kāi)后處理1、到達(dá)目標(biāo)展距，立即取出標(biāo)記溶劑前沿；2、立即去除平面上的展開(kāi)劑，以防定性參數(shù)測(cè)量錯(cuò)誤以及斑點(diǎn)擴(kuò)散等不良后果。二、斑點(diǎn)檢視1：光學(xué)檢測(cè)

此法使用方便，被檢出物質(zhì)不被破壞，適用于雙向展開(kāi)，多次展開(kāi)時(shí)的定位，也適用于洗脫定量時(shí)定位。是平面色譜定位的首選方法。吸收可見(jiàn)光組分可目視檢測(cè)；吸收紫外線組分可紫外光檢測(cè)；發(fā)射熒光組分可進(jìn)行熒光檢測(cè)；吸收紫外線但無(wú)紫外光譜特征的組分可利用熒光板形成的暗斑檢測(cè)。光學(xué)檢測(cè)紫外燈檢出宜在暗室中進(jìn)行，365nm常用于組分所固有或與試劑作用后產(chǎn)生的熒光，254nm則可因該組分吸收此波長(zhǎng)的光呈現(xiàn)可見(jiàn)斑點(diǎn)。若樣品系用熒光板展開(kāi)，則組分因其對(duì)板上熒光物質(zhì)的淬滅作用，將在亮的熒光背景上，呈現(xiàn)暗的斑點(diǎn)。光學(xué)檢測(cè)365nm254nm便攜式紫外檢測(cè)器(UVD)二、斑點(diǎn)檢視2：蒸氣顯色采用碘蒸氣顯示薄層板上有機(jī)物的斑點(diǎn)有很多優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速靈敏、經(jīng)濟(jì)，它是非破壞性的，并且易于在板上勾畫斑點(diǎn)。

利用一些物質(zhì)的蒸氣與樣品作用生成不同顏色或產(chǎn)生熒光。反應(yīng)有可逆和不可逆兩種，如常用的碘蒸氣。二、斑點(diǎn)檢視3：試劑顯色根據(jù)被檢出化合物的理化性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑使之生成顏色或熒光穩(wěn)定、輪廓清楚、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的斑點(diǎn)。此法是平面色譜中廣泛應(yīng)用的方法。如氨基酸的顯色定位。氣壓式噴霧器二、斑點(diǎn)檢視4：生物自顯影具有生物活性的物質(zhì)，如抗菌素等，在紙或薄層上分離后與有相當(dāng)?shù)奈⑸锏沫傊囵B(yǎng)基表面接觸，經(jīng)在一定溫度下培養(yǎng)后，有抗菌活性物質(zhì)處的微生物生長(zhǎng)受到抑制，瓊脂表面出現(xiàn)抑菌點(diǎn)而得到定位。主要用于抗菌素的效價(jià)測(cè)定、中藥才鑒定等第七節(jié)定性與定量分析

1、定性分析——日光，紫外光，顯色

2、定量分析——洗脫法，薄層掃描法（了解）1、薄層定性分析斑點(diǎn)的比移值斑點(diǎn)的顯色特性：在自然光或紫外光下根據(jù)斑點(diǎn)的熒光或顏色定性，是中藥指紋圖譜的重要鑒別方法。原位光譜掃描：通過(guò)各種圖譜掃描，可對(duì)樣品和對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比定性。薄層和其它分析技術(shù)的聯(lián)用：如氣相色譜、液相色譜、電化學(xué)法及各種光譜法等，極大的增加了薄層的定性能力。定性每種組分的Rf值在一定條件下為一常數(shù)，但由于影響Rf值的因素較多，因此根據(jù)一種展開(kāi)劑展開(kāi)后得到的Rf值作為定性依據(jù)是不夠的，需要經(jīng)過(guò)兩種以上不同組成性質(zhì)的展開(kāi)劑得到的Rf值并與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品比較，相互一致時(shí)，才可認(rèn)定該斑點(diǎn)與對(duì)照品是同一種化合物，如果二者的Rf值不同，可以作出不是同一化合物的結(jié)論。第八節(jié)紙色譜法(PaperChromatography,PC)將固定相放在紙上，以紙做載體進(jìn)行點(diǎn)樣、展開(kāi)、定性、和定量的液-液分配色譜法固定相：紙纖維吸附的水流動(dòng)相：與水不互溶的有機(jī)溶劑（飽和正丁醇）分離機(jī)制：同液-液分配色譜定性參數(shù)：討論：Rf與組分性質(zhì)、流動(dòng)相及溶解度有關(guān)極性組分→易保留，Rf?。鲃?dòng)相極性↑，Rf↑）非極性組分→易流出，Rf大（流動(dòng)相極性↑，Rf↓）第九節(jié)平面色譜的特點(diǎn)及應(yīng)用（了解）一、平面色譜的特點(diǎn)二、薄層色譜在中藥分析中的應(yīng)用三、薄層色譜在合成藥物分析中的應(yīng)用四、薄層色譜在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用一、平面色譜法特點(diǎn)1：優(yōu)點(diǎn)由于固定相是一次性使用，樣品的前處理比較簡(jiǎn)單對(duì)被分離物質(zhì)的性質(zhì)沒(méi)有限制，應(yīng)用廣泛平面色譜具有多路柱效應(yīng)，可同時(shí)平行分離多個(gè)樣品分離樣品所需展開(kāi)劑量極少，即節(jié)約溶劑又減少了污染固定相，特別是流動(dòng)相選擇范圍寬，有利于不同性質(zhì)化合物的分離應(yīng)用不同的展開(kāi)方式有利于難分離物質(zhì)對(duì)的分離同一色譜是可根據(jù)分離化合物的性質(zhì)選擇不同顯色劑或檢測(cè)方式進(jìn)行定性或定量。唯有薄層色譜技術(shù)可提供原始彩色圖像，不僅便于保存原始圖像并可通過(guò)色譜圖像分析提供多層面的信息，直觀性、可比性極強(qiáng)。一、平面色譜的特點(diǎn)2：重現(xiàn)性差層析結(jié)果受多種因素影響，如只作定性分離，則對(duì)每一步的要求和操作不很嚴(yán)格，如果要作含量測(cè)定、雜質(zhì)檢查，則每一步都要十分注意并嚴(yán)格操作，否則達(dá)不到定量