基于uvfp的舒筋活血片定量化評價

基于uvfp的舒筋活血片定量化評價

根據(jù)“健康中國與健康中國”戰(zhàn)略研究報告，中醫(yī)藥和其他中國傳統(tǒng)醫(yī)學應納入國家衛(wèi)生和福利體系。進一步提高傳統(tǒng)醫(yī)學的安全性、有效性和質量。中藥質量控制方法創(chuàng)新面臨新的時代發(fā)展機遇,因此開拓現(xiàn)代儀器分析技術的新方法迫切而重要。紫外光譜分析技術在藥物定量方面有著重要作用,但因特征信息單一導致其在中藥指紋圖譜研究方面未引起足夠重視。由于中藥提取液中包含藥味整體化學物質組分,測定其一定波段范圍的紫外指紋圖譜(UVFP)可作為鑒定中藥的簡捷準確的新的整體定量技術手段。紫外光譜能定量檢測中藥不飽和化學鍵及共軛體系的化學物質的總含量,尤其190~400nmUVFP對飽和化學鍵n→σ*也能產(chǎn)生較好地檢測,這為中藥UVFP定量方法所含信息的準確度提供了重要保證。依據(jù)UVFP特征性,本文提出了紫外指紋圖譜指數(shù)、信息量指數(shù)、波動量指數(shù)和信息波動量指數(shù)等理論以及紫外指紋定量法,形成UVFP超信息特征的數(shù)字化和定量化評價方法,并用190~400nmUVFP成功評價舒筋活血片(ShujinHuoxuetablet,SJHXT)質量。SJHXT由紅花、香附(制)、狗脊(制)、香加皮、絡石藤、伸筋草、澤蘭葉、槲寄生、雞血藤和自然銅(煅)10味藥組方。有舒筋活絡和活血散瘀之功效,用于筋骨疼痛、肢體拘攣和腰背酸痛。文獻有薄層掃描法和高效液相色譜法測定一種或幾種成分含量,均無法準確反映SJHXT質量。本文建立了SJHXT數(shù)字化和定量化UVFP并籍此評價其質量,力求客觀準確地表征其化學組分的整體含量特征。本文將UVFP研制成一種能從多維數(shù)字化和定量化角度鑒別和精準評價中藥質量的新的有效技術方法,實現(xiàn)利用UVFP清晰、便捷和精確定量化地揭示中藥復雜巨系統(tǒng)的總體量化特征。1紫外fp超過信任的數(shù)字理論1.1紫外指數(shù)理論1.1.1組分檢測和定量評價把中藥紫外光譜各點看作指紋的峰點來代表不同化學組分在該波長的吸光度加和,利用UVFP全峰點可準確定量評價中藥整體質量,除不能有效檢測飽和化學鍵組分外,其具有信息充分和定量準確可靠的優(yōu)點。1.1.2指紋分辨率i1.1.3指紋頻率1.1.4指紋可靠性lr1.1.5吸光度總成分由指紋譜與橫軸圍成的面積,是代表中藥中所有化學成分的吸光度總和。采用辛普森積分法,峰點越多時計算積分越準確。AUC是評價中藥全化學物質總含量指標,當ρ=1時即LR。1.1.6均化系數(shù)i1.1.7指紋空間利用率h1.1.8表中的輸入樣品數(shù)量q是把1mg中藥原料(制劑)提取液進樣后測定UVFP,以表觀質量表示中藥化學成分含量(單位為mg)。1.1.9中藥表面吸收系數(shù)e一定波長時,由1mg中藥原料(中藥制劑)的提取液所產(chǎn)生的吸光度,見(9)式,通常用極大值表征中藥UVFP特征。1.1.1有效信息指數(shù)ls和有效信息的指數(shù)l是綜合信號大小、均化性(γ)、分辨率(β)和有效信息量的指數(shù),見(10)式。F代表指紋總強度、均化性、分辨率和信息量大小,它直接反映指紋信息多寡和信號大小及均化性。1.1.11.標準fr指數(shù)q1.1.12.固波長指數(shù)fr1.1.1中藥原料制劑表觀質量f將1mg中藥原料(制劑)提取液進樣后在200nm連續(xù)譜段檢測獲得的F,稱為相對指紋指數(shù)Fr,見(13)式。它綜合指紋總強度、均化性、信息量、波段效率和中藥原料(制劑)表觀取量等多維信息。n為指紋數(shù)、γ為均化系數(shù)、β為指紋分辨率、Ai為指紋吸光度、A0是n個指紋點幾何均數(shù)、Q是與一次進樣量相當?shù)闹兴幵?制劑)表觀質量(μg)。當DAD檢測器采集1000個峰點Ai=1.0時,若γ=0.1、ρ=1和β=1,則F≤100;由絕對進樣量決定Fr<100。1.2紫外信息理論1.2.1峰點熵si根據(jù)信息量理論定義光譜各峰點熵見(14)式,pi為各峰點吸光度歸一化值見(15)式,Ai是各峰點吸光度,AT是總吸光度。1.2.2總熵s1.2.3信息指數(shù)i1.2.4標準信息指數(shù)iq1.2.5內部波長信息指數(shù)i1.2.6相對潛在風險指數(shù)由1mg中藥原料(制劑)提取液進樣后,在200nm波段檢測獲得I稱為相對信息量指數(shù)Ir,見(20)式。它綜合信息量總強度、均化性、波段效率和取樣量等多維信息。1.2.7指數(shù)反比i1.3指紋偏差倍率1.3.1駐點數(shù)(Nsp)是指紋上一階導數(shù)為零點個數(shù)即曲線上的極值點數(shù),Nsp代表指紋波動性。Nsp越大波動度越大,但平滑會使之減少。1.3.2指紋極差(R)是指紋極大值與極小值之差,能表征曲線上指紋分布最大變異范圍和離散程度,R越大則離散越大。1.3.3極差倍率(Rstd)是最大吸光度與光譜極差R之比,見(22)式,反映指紋分布變異性和離散程度,Rstd越大離散越強。1.3.4中位比(m)是平均吸光度與最大吸光度之比,見(23)式,可反映指紋點集中趨勢,m<0.5說明吸光度較小點多,m>0.5說明吸光度較大點多,當m=1說明指紋所有點均等,此時均化性最好但特征性很差。1.4紫外波動指數(shù)理論1.4.1信號傳遞度指數(shù)化率為4.是考慮指紋均化性γ、駐點數(shù)Nsp、極差倍率Rstd、有效信息熵和總強度的指數(shù),見(24)式,它綜合反映信號總強度、有效信息量、均化性和波動度大小。當最理想時γ=1、Nsp=0、m=1和Rstd→∞,顯然,此時AF為各點吸光度常用對數(shù)和,AF越大則均化性、信息量和信號越大。1.4.2標準波動指數(shù)alrq1.4.3定波長波動量指數(shù)afr將UVFP折算成在200nm波段獲得的AF稱為定波長波動量指數(shù)AFr(λ),見(26)式。波段越小則波動率越高,AFr(λ)是整合指紋總強度、有效信息量、均化性、波動度和波段效率等信息。1.4.4相對波動量指數(shù)afr由1mg中藥原料(制劑)提取液進樣后,在200nm波段檢測獲得AF稱為相對波動量指數(shù)AFr,見(27)式。是綜合指紋總強度、有效信息量、均化性、波動度、波段效率和中藥原料(制劑)取量等多維波動信息指數(shù)。1.5信息波動指數(shù)的譜法1.5.1彈性指數(shù)是考慮均化性γ、駐點數(shù)Nsp、極差倍率Rstd和空間效率以及有效信息量,能反映總信息量波動性的指數(shù),見(28)式。當最理想時γ=1、Nsp=0、Rstd=∞時有,AI越大則有效空間信息量的波動度越大。1.5.2標準信息的波動指數(shù)q1.5.3波長信息波動量指數(shù)將UVFP折算成在200nm波段獲得的AI稱為定波長信息波動量指數(shù)AIr(λ),見(30)式。波段越小則指紋鑒定效率越高,AIr(λ)整合了信號總強度、有效空間信息量、均化性、波動度和波段效率等信息。1.5.4相對信息波動量指數(shù)由1mg中藥原料(制劑)提取液進樣后,在200nm波段檢測獲得AI稱為相對信息波動量指數(shù)AIr,見(31)式。是綜合信號總強度、有效空間信息量、均化性、波段效率和中藥原料(制劑)取量等多信息指數(shù)。1.5.5反演率a'1.6宏定量相似度pm監(jiān)測和類uvfp、mi紫外指紋定量法是以光譜點為計算單元,用宏定性相似度Sm監(jiān)測紫外指紋數(shù)量和分布比例,見(33)式;用宏定量相似度Pm監(jiān)測紫外指紋含量狀況,見(34)式,同時用變動系數(shù)α限定紫外指紋變異性,見(35)式。xi與yi分別為樣品和對照UVFP各峰點吸光度,mRFP和mi分別為對照UVFP和樣品的進樣質量。用Sm、Pm和α鑒定中藥質量。2建立rap方法2.1在aglent0103中的應用紫外光譜能反映中藥中化學組分π→π*,n→π*及n→σ*化學鍵信息,由于不同的化學成分體系紫外吸收曲線具有指紋特征,故UVFP可用于中藥及其制劑質量鑒定。采用流動注射分析(FIA)方式采集UVFP,見圖1,即用空管路替代色譜柱,以DAD采集在線紫外信號至樣品無吸收為止,在Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)下完成分析。該系統(tǒng)流動相與試樣間混合狀態(tài)高度重現(xiàn),故該法具有穩(wěn)定和重現(xiàn)的特點。2.2測定數(shù)據(jù)的平均化階段采用第2種方法標準(對照)UVFP生成方法有2種,(1)采用10批以上有代表性的中藥原料(藥材、提取物、配方顆粒等)或各類中成藥經(jīng)優(yōu)化的提取方法獲得的供試液所獲得紫外光譜全峰點進行均化計算得到標準(對照)UVFP,是一個平均化模式。(2)用地道藥材(標準藥材)或標準中成藥制劑的供試液直接進樣測定標準(對照)紫外UVFP,一般為連續(xù)測定6次的平均化模式。顯然首推第2種方法更可取和更易實現(xiàn)隨行對照定量,當然固定好恒定參照系是定量UVFP研究的關鍵所在。排除不同儀器間系統(tǒng)誤差對照UVFP可作為直接定性定量的標準依據(jù)。2.3uvfp的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性依據(jù)樣品提取方法,可建立a.水溶性成分UVFP,b.脂溶性成分UVFP,c.全成分UVFP,d.特征有效組分群UVFP,提取方法的恒定性決定著UVFP的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性特征。UVFP具有測定快速(分析時間<1min),穩(wěn)定性和重現(xiàn)性高,定量信息豐富(因波長范圍寬),定量準確度高和數(shù)字化特征顯著等特征。因此紫外UVFP盡管定性特征性單一,但所提供峰點的定量信息具有全面性和整體性,其全面反應了中藥中化學成分中不飽和化學鍵產(chǎn)生的定量全信息,從整體角度考慮其比HPLC紫外單波長檢測具有更全面和更準確的特點。3實驗部分3.1儀器、設備和儀器Agilent1100型液相色譜儀(DAD檢測器、四元低壓梯度泵、在線脫氣裝置、自動進樣器),ChemStation工作站(Agilent科技有限公司),Sarturius-BS110S分析天平(北京賽多利斯天平有限公司),DHG-9140A鼓風干燥箱(上海合恒儀器設備有限公司)。3.2藥品、制劑、專四品種、專藥開發(fā)概況見表1甲醇(色譜純,山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠),磷酸(色譜純,沈陽經(jīng)濟開發(fā)區(qū)試劑廠),無水乙醇(分析純,康科德科技有限公司),水為去離子水。14批SJHXT中S1、S6、S13和S14三門峽莘原制藥有限公司(批號:101006、100311、110713、110701);S2和S9河北世濟唐威藥業(yè)有限公司(批號:D11155、D11158);S3山東健民藥業(yè)有限公司(批號:100302);S4河南省百泉制藥有限公司(批號:100701);S5長春經(jīng)開藥業(yè)有限公司(批號:20090502);S7河南明康制藥有限公司(批號:20110302);S8和S10洛陽君山制藥有限公司(批號:110601,101104);S11哈藥集團三精黑河藥業(yè)有限公司(批號:101201);S12丹東藥業(yè)集團有限公司(批號:101102133)。此14批SJHXT均購自于沈陽市藥店。3.3提取濾液制備濾液制備液取SJHXT10片,精密稱定,除去薄膜衣并研碎,取約2.78g,精密稱定,加甲醇50mL,回流提取1h,過濾,殘渣加甲醇40mL再回流提取1h,過濾,殘渣再加水40mL繼續(xù)回流1h,濾液減壓濃縮至16mL,加入95%乙醇84mL,靜置12h后,將濾液與前2次濾液合并后減壓濃縮至16mL,用甲醇定容至25mL,搖勻即得。3.4色譜條件、標準曲線Agilent聚四氟乙烯(PTFE)管(650mm×0.12mm),柱溫(30.0±0.15)℃,流動相為色譜甲醇,流速0.5mL·min-1,進樣量0.2μL,檢測波長190~400nm(DAD),采集間隔1nm,狹縫寬度1nm。4結果與討論4.1試驗條件和方法的研究4.1.1速度選擇4.1.2紫外吸收光譜auc的測定按“3.4”項下檢測條件,在流速0.5mL·min-1平衡柱系統(tǒng),在進樣量分別為0.10、0.20、0.30、0.50、0.70、0.90和1.10μL考察190~400nm紫外吸收光譜。結果AUC與絕對進樣量Q(mg)呈良好線性關系:AUC=20471+193120Q,r=0.996,線性范圍0.10~1.10μL(制劑表觀質量為0.0108~0.1189mg?；?D譜并扣除Nearestbaseline提取峰頂點紫外光譜,以吸光度在600~800mAU為宜,最終確定進樣量0.20μL,見圖2B。4.1.3檢測時間和穩(wěn)定性試驗將S2號供試液進樣0.20μL,記錄6波長(210、228、246、265、286和326nm)非分離色譜圖和190~400nm在線紫外光譜。因所有組分在1min內出峰完全,故確定檢測時間為1min,此系統(tǒng)理論板數(shù)≥54。4.1.4精密度和穩(wěn)定性試驗將S2號SJHXT-UV供試液連續(xù)進樣6次,記錄6波長下非分離色譜圖和190~400nm在線紫外光譜。以228nm時非分離色譜圖考察進樣精密度,計算其保留時間RSD均<1.1%,峰面積RSD<1.1%。表明進樣精密度很好。同時取S2號供試液,分別在樣品制備后0、1、2、3和4h進樣,結果保留時間RSD均<1.2%,峰面積RSD<1.4%。表明樣品在4h內基本穩(wěn)定。4.2指紋圖譜評價采用FIA法測定14批SJHXTs在190~400nmUVFP見圖3,將14批樣品CSV文件導入孫國祥等開發(fā)的“中藥光譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”軟件,參照HPLC指紋圖譜結果選則S1、S2、S9和S12以外的10批SJHXTs文件按均值法計算紫外對照指紋圖譜(UV-RFP),以其評價14批樣品Sm、Pm和α值,依據(jù)UVFQM標準鑒定S7和S9質量好(3級)、S10質量良好(4級)、S4和S8質量一般(6級)、S6質量差(7級),其余質量均劣(8級),見表1。4.3指紋圖譜結果分析用孫國祥等開發(fā)的“中藥光譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”軟件評價SJHXT-UVFP見表1。(1)β=1及ρ=1說明指紋點數(shù)和單色光純度符合要求。(2)LR=14125~86672,A0=48~318,A=67~411,AUC=14090~86528,說明指紋信號強度較高。(3)γ=0.759~0.897,δ=0.656~0.819說明指紋均化性很好。(4)Nsp=7~11,R=209~1250,Rstd=1.019~1.053說明指紋分布較均勻。m=0.264~0.565說明吸光度較小點多。(5)F=10.1~16.6,S=5~5.2,I=24.8~46.2,AF=15.6~33.5,AI=16~39.8說明其指紋總強度較高、均化性較好、所含信息量豐富、指紋圖譜波動度較小,但以S1波動度最大。Fr=14.0~17.9,Ir=41.1~59.5,AFr=16.0~33.5和AIr=15.2~37.9都較高,說明此圖譜波段效率和中藥原料(制劑)提取液中所含化學成分信息都很高。Fr(λ)、Ir(λ)和AFr(λ)均高于原來F和I值,說明波段效率高;Fr(q)、Ir(q)、AFr(q)和AIr(q)均高于原來F和I值,說明樣品所含化學信息量豐富。(6)其中S1的F=29.8,I=83.2,AF=83,AI=124.2均遠遠高于其他批次,說明該批次圖譜波動性較大。(7)根據(jù)實驗結果,把SJHXT的16個指數(shù)的±15%作為限度來控制14批SJHXT,對于F、Fr、Fr(t)和Fr(q)四指數(shù)來說,S6和S7低于低限(LPL),S1和S5均高于高限(HPL);對于I、Ir、Ir(t)和Ir(q)四指數(shù)來說,S6、S7、S13和S14均低于LPL,S1和S5高于HPL;對于AF、AFr、AFr(t)和AFr(q)四指數(shù)來說,S6和S7低于LPL,S1、S5、S8和S12均高于HPL;對于AI、AIr、AIr(t)和AIr(q)四指數(shù)來說,S6、S7、S13和S14均低于LPL,S1、S3、S5、S9和S12均高于HPL,結果見表2。4.4與其他批數(shù)法比較對比SJHXT的HPLC指紋圖譜和UVFP的評價結果可知,除S5和S9質量等級相差5級,其余各批次評價結果均相差2級以下,由于UVFP是以波段為210nm數(shù)據(jù)按點來計算總含量,其結果更準確,而文獻方法是在228nm測定的HPLC指紋圖譜,結果具有片面性,見圖4。5峰點和波長的選取及指紋指數(shù)的計算本文提出了紫外指紋圖譜指數(shù)、信息量指數(shù)、波動量指數(shù)和信息波動量指數(shù)等理論以及紫外指紋定量法,形成中藥紫外指紋圖譜超信息特征的數(shù)字化和定量化評價方法。應用“中藥光譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)3.0”軟件對SJHXT-UVFP隱含的定性和定量信息進行挖掘,共建立46個超信息特征參數(shù)。用流動注射分析(FIA)法采集190~400nmUVFP來重點反映中藥化學組分中的π→π*,n→π*和n→σ*化學鍵定性定量信息。評價出S7和S9質量好(3級),S10質量良好(4級),S1波動度很大表明該中藥可能加入了其他西藥化學成分。本文利用UVFP對SJHXT嘗試進行數(shù)字化和定量化整體質量評價,是表征中藥化學組分總含量特征的創(chuàng)新。本文開拓了多維數(shù)字化和定量化UVFP鑒別和精準評價中藥質量的新方法,實現(xiàn)了利用UVFP定量化評價中藥復雜巨系統(tǒng)的總質量。若連續(xù)光譜相鄰波長間隔為△λ,狹縫寬度為d(nm),則定義指紋分辨率見(1)式,n為測定峰點數(shù),λ1和λ2分別為掃描起始和結束波長。相鄰波長間隔越大(△λ越大)或狹縫d越小則n越大,即采集峰點越多或單色光越純。因此β代表峰點多少和單色光純度,在指紋點足夠豐富和單色光純度滿足要求時β越大越好,通常β=1。是單位波長內采集峰點數(shù),見(2)式,一般為1,也可以為2。是連續(xù)光譜各峰點吸光度總和,見(3)式。Ai(Ti)為第i個光波長的吸光度(透光率),LR代表信號總強度,一般越大越好。指紋點分布均化性直接影響指紋特征性,當峰點呈直線時特征性最差。計算和指紋向量間夾角余弦即求出與定性相似度系數(shù)γ,見(4)式。為平均吸光度,γ越接近1則信號均化性越好,但特征性越差。信號強度也可用峰點幾何平均吸光度A0和平均吸光度表示,見5~6式。當時,有γ≈1表明特征性越差。兩者比δ稱為幾平比,見(7)式,同樣δ越接近1,特征性越差。是指紋AUC占最大光譜面積的百分數(shù),見(8)式。由1mg中藥原料(制劑)的提取液進樣后檢測獲得的F稱為標準指紋指數(shù)Fr(q),見(1