京尼平交聯(lián)明膠材料的特性研究

京尼平交聯(lián)明膠材料的特性研究

1低毒性交聯(lián)劑由于其良好的生物兼容性和可分解性，明膠在醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但是,因為體溫下水溶性好、體內(nèi)降解快,經(jīng)常要交聯(lián)后使用。常用的交聯(lián)劑一般都有相當強的毒性,如戊二醛,所以尋找新的低毒性交聯(lián)劑成為一個研究方向。京尼平是近年來開始研究的一種交聯(lián)劑,可用其交聯(lián)明膠、膠原等材料,是傳統(tǒng)中藥杜仲的活性成分之一,其最大優(yōu)點在于毒性很低。國內(nèi)尚鮮有關(guān)于京尼平作為交聯(lián)劑的報道,國際上也缺乏詳細的京尼平交聯(lián)明膠特性隨交聯(lián)時間變化的報道,所以本實驗研究了京尼平交聯(lián)明膠的交聯(lián)度、細胞毒性、溶脹度和降解率等特性隨交聯(lián)時間變化的情況。2材料和方法2.1分光光度計和mtt明膠(BIOBASICINC生產(chǎn));京尼平(日本和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn));茚三酮(購自Sigma公司);分光光度計(UnicoWFZUV-2100spectrophotometer,Shanghai,China);MTT(購自Sigma公司)。MultiskanMk3酶標儀(上海Thermo生產(chǎn))2.2京尼平的制備材料分為7組,即交聯(lián)10min、30min、1h、2h、12h、24h、72h組。10mg明膠放入2ml離心管內(nèi),在100℃水浴中加熱1h,對明膠及離心管進行消毒,再冷卻至40℃,然后加入20μl無菌的京尼平溶液(含京尼平0.3mg),使京尼平在材料中的質(zhì)量百分比為1%,交聯(lián)10min、30min、1h、2h、12h、24h、72h后,得到相應(yīng)組材料。制作過程注意無菌操作。2.3材料檢測方法2.3.1樣品的制備和標準曲線的繪制交聯(lián)度反映明膠中與交聯(lián)劑反應(yīng)的氨基酸占總氨基酸數(shù)量的百分比,其值越高說明反應(yīng)越完全,是反映明膠交聯(lián)程度的重要指標。參照Yao等的方法,交聯(lián)度測定采用茚三酮法。茚三酮法被廣泛用于蛋白質(zhì)交聯(lián)度的檢測,它可與樣本中的自由α-氨基酸反應(yīng)生成藍紫色的色素,色素多少與自由α-氨基酸的量成正比。具體方法如下:①1.05g的檸檬酸(citricacid)和10ml(1.0M)的NaOH和0.04g的氯化亞錫(SnCl2·2H2O)混合,加去離子水調(diào)至25ml,另將1g的茚三酮(ninhydrin)加入25ml乙二醇甲醚(ethyleneglycolmonomethylether)中,再將上述兩液體混合攪拌45min,制成茚三酮溶液,存于黑瓶中備用。②京尼平交聯(lián)明膠材料以及未加京尼平的等量明膠放入300μl去離子水中,同時設(shè)置空白對照,靜置60min,再加3ml茚三酮溶液,100℃加熱20min。③冷卻至室溫,加15ml異丙醇(isopropylglycohol),用分光光度計在570nm下測量吸光度。④用5μmol/ml的甘氨酸溶液做標準曲線,并通過此標準曲線查找各樣本中自由α-氨基酸的摩爾數(shù)。所有反應(yīng)在暗室進行。以M明膠組表示未加京尼平的等量明膠中含自由α-氨基酸摩爾數(shù),M樣品組表示各組樣品中氨基酸摩爾數(shù),按以下公式計算各組材料的交聯(lián)度:CI=(M明膠組-M樣品組)/M明膠組×100%2.3.2材料wo溶脹度反映材料吸水膨脹的性能,降解率反映材料抗水解能力。各組受試材料各10個無菌條件下稱重(Wo),然后加2mlPBS溶液。24h后取出,用消毒過的濾紙擦干水分后稱重(W1)。溶脹率=(W1-Wo)/Wo×100%。將材料放回離心管中封裝好,3d換液1次,每周取出用濾紙擦干水分后稱重(W2)。降解率=(W1-W2)/W1×100%。2.3.3細胞增殖度檢測參照李靜等的方法,簡述如下:依據(jù)國家標準方法按照1cm2/ml比例用1640培養(yǎng)液浸提7組材料制備浸提液,將(購自北京協(xié)和基礎(chǔ)所細胞中心)V-79中國倉鼠細胞種植于96孔板,分為8組:陰性組(單純培養(yǎng)液)、10min組、30min組、1h組、2h組、12h組、24h組、72h組,每組8孔。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后觀察細胞形態(tài)并做MTT檢測。根據(jù)所測定的各組OD值按照下述公式分別計算各實驗組細胞相對增殖度(RGR):RGR=試驗組平均OD值/陰性對照組平均OD值×100%。按照表1將各組的RGR轉(zhuǎn)換成6級細胞毒性以評定材料的毒性程度(見表1)。2.4統(tǒng)計用SPSSv11.5軟件進行數(shù)據(jù)分析,參數(shù)值用均數(shù)和標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,各組間比較采用單因素方差分析。3結(jié)果3.1醫(yī)療銜接度:n隨時間延長交聯(lián)度增加,交聯(lián)10min時,交聯(lián)度只有26.7%;交聯(lián)30min時,交聯(lián)度為45.7;交聯(lián)72h時,交聯(lián)度為73.1%(見表2)。3.2兩組的溶脹度隨時間延長溶脹度降低,10min組的溶脹度為265%±26%;30min組的溶脹度為207%±27%,與10min組比有顯著性差異;72h組溶脹度為153%±22%,與30min組比有顯著性差異(見表2)。3.3min組降解情況隨時間延長,降解率降低,降解時間延長。10min組不到一周即完全降解;30min組4周時還未完全降解,降解率18.3%±5.2%,8周完全降解;30min后各組降解率逐漸降低,72h組到12周時,僅少量降解,降解率15.6%±5.3%(見表3)。3.4細胞毒性試驗鏡下可見,各組京尼平材料浸提液培養(yǎng)的細胞生長良好。MTT檢測細胞增殖度在87.9和105.2之間,細胞毒級為1,均屬合格(見表3)。4討論4.1其他傳統(tǒng)中藥明膠和膠原蛋白一般由動物組織如皮膚、骨中提取。明膠是膠原降解產(chǎn)物,是一種多肽,組織相容性好,與膠原相比抗原性明顯降低。明膠廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域,包括膠囊、微球、生物膠、傷口敷料、可吸收填充材料等,最近還有報道明膠用于制作人工皮膚和骨、神經(jīng)修復材料。明膠主要缺點是在體溫和液體環(huán)境下快速溶解,所以使用前一般要先經(jīng)過交聯(lián)等處理,以增加其降解時間和力學強度。京尼平與其它交聯(lián)劑相比具有低毒性的特點,它是傳統(tǒng)中藥杜仲的活性成分之一,是從京尼平甙中分離、提純而獲得的。京尼平和它的環(huán)烯醚萜化合物常被作為一種消炎利膽藥應(yīng)用于治療各種肝膽疾病(可以促進膽汁的分泌)和感染癥狀。京尼平是環(huán)烯醚萜類雜環(huán)化合物,具有-OH、-COO-等多個活性官能團。它與氨基酸或蛋白質(zhì)反應(yīng)可生成一種無毒的深藍色色素,可用于食品染料。最近國外有一些關(guān)于使用京尼平作為膠原、明膠的交聯(lián)劑的報道,而國內(nèi)尚未見報道。4.2京尼平加固明膠的發(fā)揮因子分析和細胞毒性實驗研究,主要有利用三酮法測pbs和tt等方法將材料基由結(jié)果可見,京尼平可有效交聯(lián)明膠,隨交聯(lián)時間延長,交聯(lián)度增加,溶脹度和降解率降低。交聯(lián)10min的材料,交聯(lián)度低(26.7%),溶脹度高(265%),不到一周就完全降解,說明材料很不穩(wěn)定,易降解;交聯(lián)30min的材料,交聯(lián)度、溶脹度、降解率與10min材料比都有明顯變化,在水中4周未完全降解,說明京尼平可以在30min內(nèi)顯著改變明膠性能。30min后的材料,隨交聯(lián)時間延長,交聯(lián)度逐漸增加,溶脹度和降解率逐漸降低,交聯(lián)72h的材料,交聯(lián)度為73.1%,溶脹度為153%,12周僅少量降解(15.6%),說明交聯(lián)比較完全。Bigi等使用了TNBS法測京尼平交聯(lián)明膠的交聯(lián)度,他們將明膠膜置于10ml1%京尼平溶液中交聯(lián),測得的交聯(lián)度為85%。Yao等用1%京尼平交聯(lián)明膠48h,用茚三酮法測得交聯(lián)度73.1%,溶脹度約150%,在PBS中浸泡12周后降解不到10%,其材料制作方法和結(jié)果與我們相似。細胞毒性試驗是反映材料生物相容性的重要指標,本實驗中見到材料浸提液對成纖維細胞增殖無明顯影響,說明京尼平交聯(lián)明膠材料具有良好的細胞相容性。Sung等報道,通過MTT試驗和細胞集落試驗,發(fā)現(xiàn)京尼平交聯(lián)的材料毒性都遠低于戊二醛材料。在戊二醛交聯(lián)制品上所接種的細胞無一存活,而在培養(yǎng)3d后的京尼平交聯(lián)的制品上就布滿了3T3成纖維細胞,而且還觀察到了由這些細胞所產(chǎn)生的膠原纖維。4.3京尼平的產(chǎn)生和使用對于要植入體內(nèi)的材料來說,最重要的兩個特性是降解率和生物相容性,它們直接關(guān)系到材料是否可用。通過以上討論可見,京尼平交聯(lián)明膠材料的降解率可以通過交聯(lián)時間調(diào)節(jié),各交聯(lián)時間組的材料都未發(fā)現(xiàn)明顯細胞毒性,可見此材料可能可以安全用于體內(nèi)。在外科手術(shù)過程中,經(jīng)常會使用性質(zhì)在5~30min內(nèi)發(fā)生明顯變化的材料,比如骨水泥,一般固化時間在10~15min,時間過短,難以根據(jù)術(shù)中需要塑形,時間太長則延長手術(shù)時間,增加麻醉意外、出血、感染等風險。所以京尼平在30min內(nèi)顯著改變明膠性能這一特性提示我們,可能可以在手術(shù)中根據(jù)需要臨時制作京尼平交聯(lián)明膠材料或京尼平、明膠復合其他物質(zhì)的材料并植入體內(nèi),以達到填充、修復等目的;另外京尼平良好的生物相容性也支持這種使用方式。這種使用方式在世界上尚未見報道,是我們下一步要研究的內(nèi)容。交聯(lián)72h的材料12周后僅有少量降解(