四逆散的藥對配伍作用及機制研究

四逆散的藥對配伍作用及機制研究

1中藥成分的活性評價研究尚需要深入評價中藥方劑是中醫(yī)辨證論治、理法方劑的重要手段之一。多年來，它的獨特規(guī)律和療效得到了臨床實踐的證實。多年來的研究已在一定程度上闡明了許多方劑作用的機理和物質基礎,這些物質基礎包括黃酮類、皂苷類、生物堿類、萜類、內酯類等成分,不僅賦予了中藥方劑作用的科學性,而且已成為新型中藥新藥研究的主要參考依據(jù)之一。如將某些成分作為新藥的指標成分或有效成分用于質量監(jiān)測,在五類中藥新藥中,更直接以某一類或幾類成分作為有效部位,這些標準的建立通常有賴于中藥化學和分析方法手段的建立與成熟。在活性評價方面,通常采用拆方、單方及提取分離化學成分直接進行,但對于方劑中某一成分在全方作用中的地位及其與其他成分的相互作用,如協(xié)同、拮抗等,尚缺少理想的手段。眾所周知,中藥方劑是一個十分龐大的化學成分大復方,除前述的各類化學物質外,還包括一些通常被認為是無效或未被認定為有效的物質成分,如鞣質、黏液、色素、無機離子等。如何評價成分是否具有活性,除了直接獲取成分進行試驗外,似乎沒有更好的辦法。其中一些成分的分離純化和活性證明均十分困難,即使是常見的成分也受到含量多少、分離純化方法等因素的制約。因此,要闡明所有成分的活性似乎是不可能的,更何況成分之間本應該存在各種相互作用,后者正是中藥方劑整合作用的根本。鑒于中藥方劑整合調節(jié)的作用特點,我們認為,方劑的研究應兼顧物質基礎的闡明及物質基礎間的相互作用。前者比較容易進行且已取得很大的進展,后者的證明則十分困難。這不僅因為物質基礎眾多,還由于對主要物質基礎與次要物質基礎甚至無關物質基礎的界定十分困難,而物質基礎間的相互作用則使情況更加復雜。因此,目前對于中藥成分在方劑中的作用尚缺少理想的評價方法,雖有拆方的方法,但無拆成分的方法;雖有使用成分進行直接評價活性的方法,但欠缺成分與全方整合作用關系的評價方法。這些欠缺在一定程度上制約了對中藥方劑的深入評價。基于這些考慮,我們數(shù)年來作了一些探索,取得了一些經(jīng)驗,可為方劑中成分間的相互作用提供參考。下面以疏肝解郁的基本方四逆散的研究為例,淺談一些思路。2逆散改善肝損傷的作用機理復方的多成分、多作用環(huán)節(jié)和多靶點等特點已為人們所接受,這些成分是如何作用的?有無主次之分?互相之間有無影響?等等,這些問題是闡明方劑作用的重要組成部分。我們從整體作用到細胞和分子水平的活性,從全方的作用到藥對、從單體成分的配伍到成分的特異性剔除等多個角度探討了四逆散的作用。以肝炎為例,肝內免疫反應已被公認為造成肝損傷的重要機制之一,對于肝炎的治療來說,不僅需要抗病毒藥,還需要保肝藥物以及能抑制肝內免疫應答的藥物。這說明復雜的病情要求有多種治療方案,從研究角度,就需要有多種的評價體系相對應。我們發(fā)現(xiàn),四逆散對四氯化碳、卡介苗加脂多糖以及三硝基氯苯導致遲發(fā)型變態(tài)反應(PCl-DTH)等不同機理所致的肝損傷均有顯著的改善作用,其中PCl-DTH肝損傷系我們研究室首創(chuàng),通過對該模型的研究及比較四逆散對其他模型的作用,我們認為,肝炎中肝細胞的損傷至少包括效應細胞/分子和靶肝細胞兩方面的因素,藥物改善肝損傷既可通過被動地保護肝細胞來實現(xiàn),也可通過主動地消除引起肝細胞損傷的因素,包括消除肝浸潤淋巴細胞的功能等。四逆散改善肝損傷的作用機理正是包含了保護肝細胞膜和抑制肝浸潤淋巴細胞兩個方面。這種集被動和主動效應于一體的活性使四逆散對于肝損傷的綜合療效得以發(fā)揮,亦提示方劑研究應根據(jù)疾病的性質而選擇相應的復數(shù)評價指標,甚至建立新的評價體系。在這些作用中,四逆散全方用藥作用明顯優(yōu)于各單味中藥;各單味藥中,肝細胞膜保護作用以柴胡較強,甘草次之,白芍與枳實較弱;對免疫細胞功能的影響以白芍較強,甘草次之,柴胡與枳實較弱。提示方中各組成中藥分別作用于肝損傷過程的不同環(huán)節(jié),全方作用優(yōu)于各單味中藥系其對疾病過程中不同靶點綜合效應的結果。四逆散的其他藥效學試驗(如對接觸性皮炎的抑制作用)及其機理亦體現(xiàn)出類似的特點,即不同成分具有不同的作用,因篇幅所限,這里不作詳細闡述。這些結果表明,方劑中的不同藥物具有不同的功能,絕非某些單一指標所能囊括,需要多指標的評價體系。這些功能的主要承擔者顯然與其所含化學成分有關,如何進一步探討眾多成分的作用應是方劑研究的重點之一。3柴胡皂苷a的細胞活化作用為探討四逆散中成分在其中的作用,我們選擇四逆散4個組成中藥的4個代表性成分柴胡皂苷a、芍藥苷、柚皮苷、甘草酸,分別探討了這些成分的效應,并檢測了其在四逆散中的含量,分別為四逆散水提取物重量的1.2%、1.4%、7.9%和2.1%。柴胡皂苷a、柚皮苷、甘草酸均可顯著抑制耳腫脹,其中以柴胡皂苷a的作用最強,甘草酸次之,而芍藥苷基本無影響。從抑制耳腫脹程度來看,各單體成分的作用弱于全方。四逆散及各主要單體成分對ConA所致脾淋巴細胞增殖有明顯的抑制作用,其中以柴胡皂苷a和甘草酸作用較顯著,芍藥苷次之,柚皮苷無明顯影響。對于接觸性皮炎模型的活化T淋巴細胞,四逆散、柴胡皂苷a、芍藥苷、甘草酸均能顯著抑制其移動能力及MMP-2和MMP-9的分泌;四逆散、柴胡皂苷a還能顯著抑制其粘附能力,芍藥苷、甘草酸僅有抑制的趨勢,而柚皮苷則無明顯影響。這些結果提示,對于上述T淋巴細胞活化過程的各個指標,柴胡皂苷a作為君藥柴胡的主要成分作用最為顯著,芍藥苷次之。上述4個成分分別在不同的指標上顯示了它們的活性,一方面證實了它們本身的作用,另一方面也說明這些成分在一定程度上分別代表了柴胡、芍藥、枳實、甘草的某些作用甚至是主要作用,可以說它們是這些藥物的主要效應成分。然而,我們在研究中也發(fā)現(xiàn)了這樣一個問題,四逆散中的柴胡皂苷a與柴胡皂苷a單獨使用時對淋巴細胞粘附作用及增殖反應的半數(shù)抑制濃度(IC50)存在較大的差異,即柴胡皂苷a單獨使用要達到與所含同等量柴胡皂苷a的四逆散同樣的抑制效果,其濃度要大得多,這表明四逆散中的其它成分協(xié)同了柴胡皂苷作用的發(fā)揮。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)對于闡明方劑的作用十分重要,提示方劑中成分間存在著相互作用,這種作用既有協(xié)同的,也有拮抗的,既有通常認為的有效成分間的作用,也存在有效成分與“無效”成分間的相互作用。這些現(xiàn)象也迫使我們不得不考慮這樣的問題:除現(xiàn)有的拆方、分離有效成分等的研究模式外,方劑研究還應該采用什么樣的方法研究成分的作用?能否進行拆成分的研究?為探討這些相互作用,我們還是先從配伍出發(fā)。4逆散的整體作用機理我們以三硝基氯苯導致小鼠接觸性皮炎模型(PCl-CS)探討了四逆散對細胞免疫反應不同階段的影響,并從四逆散所含的藥對出發(fā),研究了方中的藥對配伍。根據(jù)方劑配伍理論,四逆散中至少包含了三個以上配伍特色明顯的藥對:柴胡-芍藥(一散一收)、柴胡-枳實(一升一降)、芍藥-甘草(經(jīng)典鎮(zhèn)痛方)。鑒于藥對是最小、最簡單的復方,一個藥對也可存在于多個復方當中,了解它們的作用規(guī)律,不僅可以揭示方劑作用的特點及其配伍的科學內涵,而且可為重組復方提供科學依據(jù)。與此同時,藥對配伍又是探討方劑中各藥味相互作用的重要途徑。我們發(fā)現(xiàn),于誘導相給藥時,柴胡-芍藥、芍藥-甘草、四逆散可顯著減輕耳腫脹,柴胡-枳實僅有抑制的趨勢;體外可抑制ConA刺激的T淋巴細胞增殖及混合淋巴細胞增殖,減少IL-2的產生。這些效應中,以四逆散和柴胡-芍藥的作用較強,芍藥-甘草次之,柴胡-枳實則無影響;于誘導相給藥可顯著降低TNF-α和NO的水平,以四逆散和柴胡-芍藥作用最為顯著;四逆散、柴胡-芍藥還可顯著抑制活化的T細胞分泌MMP-2和MMP-9,柴胡-枳實、芍藥-甘草無顯著影響;對于活化T淋巴細胞粘附能力的抑制作用,亦以柴胡-芍藥和四逆散的作用較強,柴胡-枳實次之,芍藥-甘草較弱。以上結果表明,對于上述T淋巴細胞活化過程的各個指標,各藥對的作用表現(xiàn)不一,主要以君臣配伍的柴胡-芍藥的作用最為顯著,甘草有一定協(xié)同作用。這在一定程度上闡明了四逆散疏肝解郁、治療炎癥性疾病的作用機理,更為重要的是,通過藥對活性的比較,證實了四逆散組方的合理性,尤其是君臣兩藥柴胡-芍藥的配伍在大多數(shù)藥效中的作用均較強,這為其配伍規(guī)律研究打下了的基礎。接著,我們考察了四逆散中主要活性成分的配伍。四逆散各單味藥的化學成分及主要有效成分的研究相對明確,為探討全方物質基礎及其相互變化的規(guī)律提供了寶貴的信息。根據(jù)上述的4個代表性成分柴胡皂苷a、芍藥苷、柚皮苷、甘草酸藥理研究結果,同時根據(jù)HPLC測得它們在四逆散中的含量,按它們在方中所占含量兩兩配伍,于誘導相聯(lián)合給藥,發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷a-芍藥苷、柴胡皂苷a-柚皮苷、芍藥苷-甘草酸均可顯著減輕小鼠耳腫脹,抑制picrylchloride體內活化的T淋巴細胞的移動能力,并呈現(xiàn)出明顯的藥效協(xié)同作用,以柴胡皂苷a-芍藥苷配伍協(xié)同作用最為顯著。進一步將4個單體成分按方中比例同時聯(lián)合給藥,發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用更為顯著。那么,這一協(xié)同作用又是如何實現(xiàn)的呢?是否與這些主要活性成分在體內的相互作用有關?5逆散的總作用機理中藥及其方劑中活性成分的研究,通常需要分離有效成分或有效部位,其中對于活性成分的認定都是基于單體化合物的藥理學研究,這一做法的最大好處是直接反映了該化合物所具有的各種藥理活性,易于重復且比起粗制劑容易做出量效關系,因此一直作為中藥及方劑物質基礎研究的重要內容之一受到重視。但是這種研究模式同樣存在著缺陷,比如它不能確切反映該成分在全方背景下的實際作用,更不能了解其在方中與其他成分的相互作用及其結果。在這樣的背景下,我們思考能不能建立一種探討某一成分或某些成分在方劑中作用的新方法?受基因剔除和基因沉默等技術的啟發(fā),我們考慮將某一成分從方劑中特異性地除去,而保留其他所有成分(包括通常認為是有效的和無效的成分)不變。先從甘草酸出發(fā),嘗試制作了針對甘草酸的免疫親和柱,從而將甘草酸從四逆散全方中選擇性地剔除,來反向研究甘草酸在四逆散全方抑制遲發(fā)型免疫反應中的地位和作用,以期為將來更深入的方劑研究打下基礎。我們首先制作了抗甘草酸的多克隆抗體,將甘草酸與BSA偶聯(lián),合成完全抗原,紫外分光光度法證實該人工抗原同時具有載體蛋白和甘草酸的特征吸收峰。經(jīng)SDS法鑒定,證實載體蛋白上已連接有一定數(shù)目的甘草酸分子,再根據(jù)紫外光譜法和考馬思亮藍法計算抗原中甘草酸與BSA的連接數(shù)目。用該抗原免疫新西蘭兔后得到抗血清,為IgG組分,抗體的效價達1ue5fe30000。得到抗甘草酸的抗體后,我們應用其剔除中藥中的甘草酸,這是基于抗原-抗體反應的特異性,基于此原理產生的免疫親和色譜柱既能應用于物質分離亦能應用于成分分析。對于中藥成分的單克隆或多克隆抗體,已有一些實驗室制作,以ELISA用于檢測中藥或方劑中成分的定性定量評價,這對于中藥的品種鑒定及質量檢測具有重要意義,但將中藥成分的特異性抗體用于剔除中藥或方劑中的特定成分,從而反向探討該成分的作用,則系本課題組首次進行。本研究中,我們將純化抗體與Sepharose4B凝膠偶聯(lián),制備抗甘草酸的免疫親和柱,然后加四逆散提取物過柱,獲得的樣品中甘草酸含量顯著下降,下降率達95.5%,表明甘草酸已從四逆散全方中選擇性地剔除。接下來我們考察了剔除甘草酸后的四逆散樣品對接觸性皮炎小鼠脾細胞粘附IV型膠原的影響,四逆散和甘草酸均具有顯著的抑制作用,而四逆散剔除甘草酸后的樣品僅顯示出輕微的抑制作用。換言之,甘草酸的剔除降低了四逆散對淋巴細胞粘附的抑制作用,表明甘草酸在四逆散抑制淋巴細胞粘附過程中起著主要作用。此外,剔除甘草酸亦可顯著阻斷四逆散對抗原致敏小鼠脾淋巴細胞分泌MMP-2和MMP-9的抑制作用。除甘草酸外,四逆散中還包括一些其他的活性成分。例如,柴胡中的柴胡皂苷具有抗炎、抗變態(tài)反應、影響T細胞功能、保肝、抗病毒、抗腫瘤等作用;白芍中芍藥苷可調節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛及保肝;枳實中柚皮苷具有抗氧化作用等。如前所述,四逆散的治療效果體現(xiàn)了許多化學成分的整合效應,嘗試從中藥方劑中選擇性地剔除一個或多個化學成分,將有助于闡明中藥方劑的作用機理。我們還用同樣方法制作了剔除柴胡皂苷、柚皮苷和芍藥苷后的四逆散樣品,這些抗體均具有很高的特異性。如抗柚皮苷抗體與芍藥苷、柴胡皂苷a和甘草酸的交叉反應率均<1%,與橙皮苷的交叉反應率<2%,成功剔除柚皮苷后的四逆散樣品中,未觀察到其他峰的明顯變化,可以認為免疫親和柱對柚皮苷的剔除是特異性的,對柚皮苷以外的其他成分基本無影響。通過這樣的方法探討某個成分被特異性剔除后的效應變化,反過來推測該成分在方中的作用,我們在針對芍藥苷的研究中則遇到了挑戰(zhàn),進一步揭示了這種反向研究方式的必要性:在一些指標的檢測中,芍藥苷的剔除并不影響四逆散的作用,而芍藥苷本身單獨使用則有這些作用,提示芍藥苷并非這些作用的主要擔當成分,經(jīng)過多次探索,發(fā)現(xiàn)芍藥苷的剔除在其他一些指標方面使四逆散的作用大大減弱,很顯然,芍藥苷后者的作用對于四逆散作用的貢獻更大,這個認識用以往的方法是很難獲取的。這一實踐進一步證實了中藥方劑成分的多靶點和多環(huán)節(jié),為闡明成分在方劑中實際作用的研究提供了新的方法。同時,這種免疫親和層析特異性地剔除中藥中特定成分的方法,對